GnRH/M2融合蛋白致敏DC疫苗对黑色素瘤B16F10细胞移植瘤的抑制

目的:制备促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)与M2的融合蛋白(GnRH/M2),研究由该融合蛋白致敏而成的DC疫苗对黑色素瘤B16F10细胞小鼠移植瘤的抑制作用。方法:构建表达载体p ET28a-ans B-CGnRH3-hinge-MVP-M2质粒,该质粒转化的工程菌在乳糖的诱导下,融合蛋白ans B-C-GnRH3-hinge-MVP-M2以包涵体形式表达,经超声破碎、洗涤和乙醇分级沉淀纯化后,通过酸水解将蛋白多肽GnRH3-hinge-MVP-M2释放出来,并通过DEAE-52阴离子交换层析进行分离。将此融合多肽致敏DC获得DC疫苗。构建黑色素瘤B16F10细胞小鼠移植瘤模型,按接种疫苗不同,分为:环磷酰胺组(CTX)、GnRH/M2融合蛋白致敏DC组(GDC)、肿瘤细胞裂解物致敏DC组(BDC)、GnRH/M2融合蛋白致敏DC+环磷酰胺组(GDCTX)、肿瘤细胞裂解物致敏DC+环磷酰胺组(BDCTX)和生理盐水组(NS),观察GnRH/M2疫苗对模型小鼠的移植瘤生长、CTL杀伤能力和T细胞增殖的作用。结果:成功构建p ET28a-ans B-C-GnRH3-hinge-MVP-M2质粒并高效表达融合蛋白。GDC组移植瘤生长明显慢于NS组(P<0.05),且与BDC组相似(P>0.05);GDCTX组抑瘤效果虽进一步提高,但与CTX组相比差异无统计学意义(P>0.05)。各实验组对B16F10细胞的杀伤作用和对T细胞增殖作用均优于阴性对照组(P<0.05或P<0.01),且GDC组与BDC组间差异不显著(P>0.05)。结论:初步证明融合多肽GnRH/M2致敏的DC疫苗能有效抑制黑色素瘤B16F10细胞小鼠移植瘤的生长。

抗肿瘤疫苗的研究进展

抗肿瘤疫苗是一种通过增强或者诱导机体对肿瘤细胞产生特异性应答的免疫治疗方式。利用肿瘤细胞或抗原物质制备抗肿瘤疫苗,促进T淋巴细胞增殖、活化以及细胞因子释放,以期达到抑制肿瘤的生长、转移和复发的目的。本文综述目前肿瘤免疫治疗的进展,着重介绍细胞疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗、树突状细胞疫苗等四类抗肿瘤疫苗,旨在探讨目前肿瘤免疫治疗学存在的问题以及肿瘤免疫在未来临床治疗中的应用。

免疫共刺激分子增强自噬小体疫苗诱导的T细胞应答

自噬小体疫苗DRibble被证实可以有效诱导小鼠和人T细胞应答,为了进一步增强DRibble疫苗诱导人T细胞应答的能力,本研究将免疫共刺激分子OX40、CD80和对照质粒分别转染至表达CMV pp65蛋白的LT3-pp65细胞系中,制备3种类型的DRibble疫苗为:Ctrl/pp65 DRibble、OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble。通过ELISA法检测不同DRibble疫苗诱导树突状细胞表达IL-12的水平,结果显示,OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导树突状细胞表达IL-12的水平显著高于Ctrl/pp65 DRibble。进一步将3种DRibble疫苗分别刺激树突状细胞后与扩增的CMV特异性T细胞共培养,通过流式细胞术检测表达IFN-γ的T细胞占总T细胞的百分比。实验结果显示,与Ctrl/pp65 DRibble相比,OX40/pp65DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导CD8+T细胞表达IFN-γ的能力显著增高,OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导CD4^+T细胞表达IFN-γ的水平也显著高于Ctrl/pp65 DRibble。实验证明免疫共刺激分子OX40和CD80修饰均可以加强DRibble疫苗体外诱导人T细胞应答的能力。

GnRH/M_2与mGM-CSF/βhCG融合蛋白致敏树突状细胞疫苗抗小鼠前列腺癌的作用

目的探讨分别负载GnRH/M_2融合蛋白和mGM-CSF/βhCG融合蛋白的树突状细胞(dendritic cells,DCs)及与多西他赛(DTX)联合应用治疗小鼠前列腺癌的效果,及其抗肿瘤作用机制。方法用GnRH/M_2融合蛋白与mGM-CSF/βhCG融合蛋白分别致敏DC,获得DC疫苗,流式细胞仪检测DC成熟度。测量各组小鼠肿瘤生长体积和重量、检测免疫小鼠脏器指数和脾细胞增殖,脾细胞对癌细胞特异性杀伤活性及小鼠外周血内细胞因子IFN-γ浓度,观察各组对荷瘤小鼠的抑瘤效果。结果与0.9%氯化钠溶液对照组比较,单独用药对荷瘤小鼠肿瘤均具有抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05),联合应用组抗肿瘤效果均优于DC疫苗单独应用组(P<0.01)。结论两种DC疫苗均能与多西他赛发挥协同抗前列腺癌作用,抑瘤效果显著增强。且联合应用也能有效抑制前列腺癌细胞RM-1荷瘤小鼠肿瘤的生长。

结核分枝杆菌热休克蛋白65对ApoE基因敲除小鼠Treg/Th17免疫平衡的影响

研究结核分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)对Apo E-/-小鼠Treg/Th17免疫平衡的影响。首先,将结核分枝杆菌HSP65蛋白免疫高脂饲喂Apo E-/-小鼠,再采用ELISA检测小鼠血清中抗HSP65抗体的产生情况,流式细胞术检测血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)和CD4+IL-17+辅助性T细胞17(Th17)的数量,ELISA检测血清中IL-10、TGF-β1、IL-17和IL-21含量,生化分析仪检测血中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量,染色法计算动脉粥样硬化斑块面积。结果发现结核分枝杆菌HSP65蛋白诱导Apo E-/-小鼠产生了高水平的抗HSP65抗体,Treg细胞及其分泌的IL-10和TGF-β1细胞因子数量明显减少,Th17细胞及其分泌的IL-17和IL-21细胞因子数量明显增加,TC、TG、HDL-C及LDL-C的含量未见改变,但动脉粥样硬化斑块的面积明显增加。由此可见结核分枝杆菌HSP65蛋白能够破坏Apo E-/-小鼠Treg/Th17免疫平衡,促进动脉粥样硬化的发展。

融合蛋白hVEGF121/βhCG与mGM-CSF/βhCG联合抗肿瘤作用及其机制

探讨m GM-CSF/βh CG(GC)和h VEGF121/βh CG(VC)两种融合蛋白联用对C57BL/6J小鼠RM-1前列腺癌和B16F10黑色素瘤的抑制效果,并对其抗肿瘤作用机制进行初步研究。采用含有p ET-28a-m GM-CSF-X10-βh CGCTP37和p ET-28a-VEGF-M2-X10-βh CG-CTP37的两个重组菌进行乳糖诱导表达,分离纯化融合蛋白。将两种蛋白制备抗肿瘤蛋白疫苗(VC蛋白疫苗和GC蛋白疫苗),并将两蛋白混合制备联合蛋白疫苗(VGC蛋白疫苗),免疫C57BL/6J接瘤小鼠,测量瘤块生长状态;检测免疫小鼠脾细胞增殖以及对肿瘤细胞的细胞毒作用;ELISA检测小鼠体内细胞因子IFN-γ和抗h VEGF抗体浓度。结果发现,在前列腺癌和黑色素瘤小鼠移植瘤模型中,与生理盐水NS组相比,各实验组均具有统计学意义(P<0.05)。其中VGC组抗肿瘤效果优于GC组和VC组(P<0.01),且对前列腺癌和黑色素瘤的抑瘤率分别达到(41.7±0.83)%和(46.4±1.27)%。由此可见,VC和GC两种蛋白联合后,通过发挥抗肿瘤免疫和抗肿瘤血管生成双重作用,高效地抑制了RM-1前列腺癌和B16F10黑色素瘤的生长。

抗βhCG多表位融合蛋白疫苗治疗实验小鼠黑色素瘤的机制研究

以融合蛋白HSP65-X10-βh CGCTP37作为免疫原,免疫荷瘤小鼠和未荷瘤小鼠,观察其对小鼠黑色素瘤B16-F10的体内治疗作用,以及其对肿瘤在体内的血管增生及肺转移的影响,并对其体内抗肿瘤的作用机理进行初步探讨。结果显示,HSP65-X10-βh CGCTP37的治疗对于小鼠黑色素瘤的攻击起到了有效的保护作用,与PBS对照组比较,实验组小鼠的平均瘤重显著降低(P<0.05);有效抑制了肿瘤细胞的血管增生和肺转移;免疫后小鼠的血清中产生了特异性的高滴度抗体。说明HSP65-X10-βh CGCTP37蛋白疫苗能够激发小鼠的有效免疫应答、抑制黑色素瘤的血管增生和转移,从而抑制肿瘤的生长。

hVEGF_(121)/βhCG融合蛋白联合化学药物对小鼠B16F10黑色素瘤抑制效应研究

将融合蛋白hVEGF121-M2-X_(10)-βhCG-CTP37作为免疫原,并分别联合化学药物环磷酰胺(CTX)和多西他赛(DTX),探索其对C57BL/6J小鼠B16F10黑色素瘤的抑制效应。将h VEGF121/βhCG融合蛋白(VC)分别与CTX和DTX联合给药(VCC、VCD),免疫接种B16F10黑色素瘤小鼠,对免疫小鼠皮内肿瘤组织周围毛细血管进行计数、测量各组小鼠瘤块体积和重量、对肿瘤组织进行切片分析、检测免疫小鼠脏器指数、MTT法检测脾细胞增殖、LDH法检测特异性杀伤活性。皮内肿瘤组织周围血管计数结果显示,与NS组比,DTX组、VC组以及VCD组均能高效抑制黑色素瘤血管生成(P<0.01);皮下肿瘤抑制结果显示,与NS组相比,DTX组和VCD组抑瘤效果最为显著,抑瘤率分别为60.0%,70.0%,其中VCD组抗肿瘤效果优于VC组或DTX组给药组(P<0.01);肿瘤组织病理学切片结果显示,VCD组的病变程度和炎细胞浸润程度最显著;对小鼠脾脏指数分析结果显示,与NS组相比,DTX组和VCD组的脾脏指数均显著增高(P<0.05);抗肿瘤免疫实验中:与NS组相比,VCD组提高了脾细胞增殖能力和细胞毒作用(P<0.05),且VCD组小鼠的脾细胞杀伤率在效靶比为20∶1、40∶1和80∶1时均具有显著性差异(P<0.05)。h VEGF121/βhCG融合蛋白与化学药物DTX初步表现出协同抗肿瘤的效果,而与化学药物CTX未表现出协同抗肿瘤作用。

VEGFⅡ/GRP融合蛋白的构建、表达、纯化及其抗小鼠RM-1前列腺癌的作用研究

设计并构建一种含VEGF和GRP抗原表位的表达载体p ET28a-VEGFI-M2-GRP质粒,将其转化至大肠杆菌中,并对重组菌进行乳糖诱导表达,超声破碎,包涵体经洗涤、溶解、透析复性、离子交换层析等方法进行分离纯化后得到目的蛋白VEGFⅡ/GRP,Western blot鉴定。建立前列腺癌RM-1细胞的C57BL/6J小鼠皮下移植瘤模型,以VEGFⅡ/GRP作为疫苗进行免疫。观察荷瘤小鼠的肿瘤生长情况计算抑瘤率,比较各组血管生成数以及ELISA检测抗VEGF抗体浓度,并研究该蛋白疫苗的抗肿瘤生长作用和抗血管生成作用。结果显示:ELISA结果表明小鼠血清中抗VEGF抗体比NS组高(P<0.05),重组蛋白VG组与NS组相比抗血管作用显著(P<0.05)。初步显示构建的重组蛋白有抑制肿瘤血管生长的作用。