一种适于PCR和LAMP检测的松木中松材线虫DNA快速提取方法

【目的】本研究旨在探索快速、简便地直接从病木中提取松材线虫DNA的方法。【方法】运用Chelex-100结合异硫氰酸胍蛋白变性缓冲液建立新的高效快速提取微量木块中线虫DNA的方法,并通过普通PCR与环介导等温扩增(LAMP)对提取的DNA进行检测验证。【结果】建立了提取线虫DNA的新方法 Chelex-100法,并对影响提取效率的Chelex-100浓度、冻融时间和煮沸时间进行了优化。Chelex-100法最适Chelex-100终浓度为1.5%(W/V),最适冻融时间为5 min,最适煮沸时间为8 min。与传统的CTAB法和蛋白酶K法比较,Chelex-100法提取的DNA得率高,相同条件下,该方法提取的DNA浓度远远大于常规方法。3种方法的OD260/280比值从大到小依次为CTAB法>蛋白酶K法≥Chelex-100法,Chelex-100法的OD260/280值显著低于CTAB法,而略低于或等同于蛋白酶K法,但这并不影响对提取的DNA进行PCR扩增。采用Chelex-100法提取松木中松材线虫的DNA,结合常规的PCR和LAMP检测,检测灵敏度高,特异性强,稳定性好;提取的松材线虫DNA的75倍稀释液再稀释32倍后进行PCR扩增,扩增产物电泳依然有清晰的条带。用新方法提取病木中线虫的DNA后进行检测,所有带病松木样品的检测结果均呈阳性,而健康黑松、马尾松、油松木屑及盘多毛孢样品的检测结果均呈阴性。此外,该提取方法简便快速,20 min内即可完成整个DNA的提取;经济方便,试剂保藏无特殊要求,单个样品提取耗费低于3.5元。【结论】Chelex-100法是一种快速有效的提取松木中松材线虫DNA的方法,此方法结合PCR和LAMP检测技术将进一步提高松材线虫的检测效率、灵敏度和准确性,可为松材线虫的野外检测提供可靠的技术依据。

淡紫拟青霉T-DNA插入突变体的表型分析

研究淡紫拟青霉T-DNA插入突变体,鉴定突变体的表型特征,为淡紫拟青霉致病机制分析及致病相关的基因克隆奠定基础。PCR检测筛选的14株T-DNA插入突变体,观察和测定菌落形态,菌落生长速率,产孢量,孢子萌发率和菌丝干质量等生物学性状,并比较突变体致病力。结果表明突变体均含有beta-tubulin基因序列,T-DNA已整合进入野生型菌株20-7的基因组中。通过与野生型菌株对比,发现突变体菌落形态发生了不同程度的改变。菌落生长速率明显增大的菌株占全部菌株的85.71%,只有BN-11菌株的菌落生长速率降低。产孢量显著变大的菌株有BN-11和BN-12,为菌株总数的14.29%。孢子萌发率发生改变的菌株占78.57%。菌丝干质量发生明显增大和减少的菌株都占全部突变体的21.43%。筛选获得了1株致病力增强的突变体BN-11和11株致病力显著降低的突变体。

淡紫拟青霉液体发酵条件的优化

【目的】对食线虫真菌淡紫拟青霉液体培养条件进行优化,从而获得优化的淡紫拟青霉液体发酵条件。【方法】研究淡紫拟青霉在不同碳源、氮源、无机盐、初始pH值下对产孢量的影响,确定了适宜的培养条件及发酵培养时间。【结果】最佳基础培养基配方为A1(g/L):葡萄糖40,NaNO320,KH2PO40.5,MgSO4.7H2O 0.5;最佳复合培养基配方为b(g/L):葡萄糖40,NaNO310,(NH4)2SO45,黄豆粉5,KH2PO40.5,MgSO4.7H2O 0.5;其他培养条件的选择结果:淡紫拟青霉最适产孢的初始pH值为6.0～7.0,发酵温度26℃,发酵培养时间为72h到80h。【结论】通过这些研究获得了淡紫拟青霉液体优化的发酵条件,为该菌大规模产生奠定基础。

厚垣普可尼亚菌航天诱变的生物学效应

为探讨厚垣普可尼亚菌航天诱变的生物学效应,对筛选得到的29个厚垣普可尼亚菌航天诱变菌株进行形态、色素、孢子形态、菌落生长速度、菌丝干重、产孢量和致病力等生物学特性检测,并测定各航天诱变菌株的耐盐性以及对苯菌灵的抗性。结果表明,厚垣普可尼亚菌航天诱变菌株各项生物学特性与原始菌株存在差异。航天诱变后的菌株菌落形态和色素与原始菌株差异明显;菌落生长速度和菌丝干重的负突变率均高于正突变率;产孢量的正突变率高于负突变率;菌株Pc-m-4、Pc-m-6、Pc-m-10、Pcm-15和Pc-m-123对南方根结线虫卵的寄生率分别为92.33%、93.67%、91.67%、90.67%和90.33%,显著高于原始菌株的寄生率(81.00%),其中,菌株Pc-m-6具有较好的苯菌灵抗性,菌株Pc-m-10对盐具有较好的耐受性。航天诱变处理对厚垣普可尼亚菌影响显著,其诱变后的优良菌株具有防治南方根结线虫的潜力。