锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

研究建立并完善了Taqman实时荧光定量PCR检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的方法。首先通过选取KHV病毒TK基因的保守序列(GenBank AB182940),利用PRIMER EXPRESS 2.0设计引物和探针。其中Taqman探针的5’端标记FAM,3’端标记TAMRA。然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应,制作标准曲线,得到病毒拷贝数与Ct值的关系为:Ct=-3.45 lgX+42.73(相关系数R2=0.989)。通过试验检测得到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数,同时,设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类病毒没有扩增反应,表现出较好的特异性。实验结果表明,实时荧光定量PCR检测KHV的方法,具有特异性好、灵敏度高的特点,可以缩短检测时间,提高检测速度,非常适合口岸进出口检验检疫的要求。

柯氏艾美耳球虫发育史的研究

柯氏艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａｋｏｆｏｉｄｉ）的内生发育包括２代无性繁殖和１代有性繁殖，第１代裂殖生殖阶段的时间为感染后至４８ｈ，第２代裂殖生殖阶段的时间为感染后４８～８４ｈ，配子生殖阶段始于感染后７６ｈ感染后９０～１３８ｈ在肠绒毛中发现成熟的配子体，感染后９６ｈ在回肠肠腺中发现卵囊，至１３８ｈ仍可见最短孢子化时间为９～１２ｈ柯氏艾美耳球虫的宿主特异性强，不感染虎皮鹦鹉、八哥。

禽流感检测方法研究进展

禽流感是一种可以感染多种禽类和人的烈性传染病,其病毒亚型众多,宿主范围广,病毒容易发生变异和重组,该病毒可以突破种间障碍感染人,具有重要的公共卫生学意义。近年来禽流感的发不仅给养禽业造成了毁灭性打击,而且该病的快速诊断与防治也提到了前所未有的高度。文章就近年来禽流感检测方法的发展概况进行了简单的综述,主要包括传统的病毒分离与鉴定、血清学诊断方法,以及为了满足快速检测的需要所发展起来的分子生物学检测方法。

猪弓形虫病特异PCR诊断方法的建立

以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法。应用人工感染的方法建立了猪弓形虫病动物模型,摸索出猪弓形虫病PCR检测的最佳条件。敏感性和特异性试验结果显示,该PCR方法最低能检测到10 个弓形虫速殖子的DNA,且与相关的8种原虫和线虫均无交叉反应,证明该PCR方法具有高度的敏感性和特异性。动物感染试验结果证明,在试验猪出现明显临床症状时(感染后第5 d),对取材的8 个组织样品用该PCR方法检测,有6个组织样品为阳性,其中检出率最高的组织为肺门淋巴结。

国内养殖鱼类和进境鱼卵中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的检测及基因分析

用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的反转录聚合酶链及该方法在来自国内养殖场的患病牙鲆和虹鳟及进口的匙吻鲟鱼卵中检测出IHNV,同时对扩增出的IHNV的DNA片段进行了序列分析。结果表明,从国内养殖的牙鲆和虹鳟中分离出的IHNV与IHNV的标准株RB-1株在序列上都具有98.1%的同源性,推导出在氨基酸序列上分别具有97%和99%的同源性。从进口匙吻鲟鱼卵中分离的IHNV与RB-1株在序列上都具有92.5%的同源性,推导出氨基酸序列有93%的同源性。系统发育树分析结果表明,从国内发病的养殖虹鳟中分离出的IHNV与进口匙吻鲟鱼卵中检测到的IHNV在进化上关系较为密切。

口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了建立检测口蹄疫的快速实用分子生物学技术,本研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法-体外等温扩增检测方法。设计了6条针对FMDV3D基因的8个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到检测仅需要75min的快速检测技术。所建立的检测方法灵敏,与实时荧光RT-PCR灵敏度相当;且具有特异性,对其他水泡性疾病病原体检测均为阴性;而且简单,不需要复杂的仪器,常规水浴锅在63.5℃即可进行,肉眼可直接观察检测结果。该方法是适合基层和现场检测而无需送至中心实验室的快速灵敏实用的分子生物学检测方法。

鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的初步表达

根据SVCV糖蛋白基因序列设计引物,在5’引物和3’引物中分别引入酶切位点。以病毒核酸为模板用RT-PCR方法扩增该段糖蛋白基因,将所得的基因片段(517和521)克隆至穿梭载体pGAPZαA/B之GAP启动子下游位点,构建含α信号肽的重组表达载体。获得的重组质粒pGAPZαA-517和pGAPZαB-521经线性化后,电击法转化毕赤酵母SMD1168菌株,构建分泌型表达SVCV糖蛋白的重组酵母菌株。酵母菌落PCR法检测表明,已成功构建分泌表达SVCV糖蛋白的酵母基因工程菌株,斑点印迹法进一步分析表明有目的蛋白的成功表达。

鱼类神经坏死病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明,其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神经坏死病毒检测,结果发现有40份阳性样品。这些结果表明,本研究所建立的实时荧光RT-PCR能对鱼类神经坏死病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高的优点,是开展鱼类神经坏死病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。

深圳出入境检验检疫局动检实验室禽流感检测情况与分析

通过深入分析深圳出入境检验检疫局动检实验室对禽流感开展的病原学检测方法和血清学检测方法,系统总结了目前动物检疫实验室禽流感检测与监测过程中常用的方法。在病原学检测方面,比较了鸡胚病毒分离鉴定方法、实时荧光PCR检测方法和乳胶凝集试验检测方法的优劣,提出了适合本实验室的病毒快速鉴定方法。鉴于生物安全的要求,对禽流感病毒检测采用施实时荧光RT-PCR,同时不断开展新的检测方法。在血清学检测方面,全面总结了在常规的HA和HI检测中的注意事项,并对近年来深圳出入境检验检疫局的血清学检测数据进行了分析。

应用多重PCR同时检测牛、羊源性成分

我们选择了3对引物A,B,C。A可扩增大多数脊椎动物(哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类)细胞色素b基因上一个371bp的区段,B可扩增位于牛mtDNAD-loop区段内的一个274bp的区段,C可扩增羊mtDNA基因上一个199bp的区段。由于3对引物扩增的产物分别相差约100bp左右,可通过琼脂糖凝胶电泳分离来并观察结果,建立了基于内对照的同时检测牛、羊源性成分的三重PCR方法。

供港猪群流感病毒的分离鉴定及流行病学调查

为了对供港猪群中的猪流感流行情况进行分析,从华南地区供港猪群中用无菌棉拭子采集鼻腔粘液样品,采用鸡胚接种方法,从供港猪群中分离出了2株不同亚型的猪流感病毒株,经国家流感中心鉴定分别为H1N1和H3N2亚型。本研究设计了猪流感常见亚型的HA和NA分型特异性引物,建立了猪流感型特异性RT-PCR检测方法;对分离鉴定的2株猪流感病毒和禽流感H5N1 HI检测抗原进行了RT-PCR检测,并对其部分HA和NA基因进行克隆测序分析。对供港猪群的血清检测结果表明:供港猪群中H1N1和H3N2亚型抗体阳性率分别为26.87%、38.26%,禽流感H5N1和H9N2亚型抗体阳性率均为0%。

H5N1亚型禽流感疫苗对供港鸡免疫效果评价

针对供港活鸡饲养周期长（85日龄～105日龄），禽流感抗体滴度要求高（21／28检测样品抗体滴度需≥4log2）的特点，在原有H5N2疫苗对供港活禽免疫效果不理想的情况下，对哈尔滨兽医研究所研制的H5N1亚型禽流感疫苗进行了免疫效果评估。结果显示，H5N1疫苗免疫效果明显高于原有的H5N2疫苗，初步推荐该禽流感灭活疫苗对供港鸡场的免疫程序为：首免7日龄～10日龄，0．3mL／只，皮下注射；二免45日龄，0．5mL／只，肌肉注射。

中美进出口水产品质量安全现状及对策研究

中美互为水产品贸易大国。通过对中美水产品贸易和质量安全情况进行分析研究发现,随着两国水产品贸易的不断发展,也逐渐暴露出药物残留时有检出、有害生物和致病微生物检出较高、我国进口水产品法律法规标准体系不健全不完善,以及进口水产品检验监管方式需要调整完善等诸多问题。建议:做好顶层设计,健全完善我国进出口水产品法律法规体系、标准体系;坚持改革创新,转变监管方式;落实企业主体责任以及加强中美交流合作,着力构建中美水产品共治新格局。

鹧鸪线粒体COII、ATPase8和3个tRNA基因序列分析及物种鉴别研究

线粒体DNA是真核生物核外遗传物质,其结构简单,发生变异的机率相对稳定,被广泛用于系统起源、进化、亲缘关系及物种鉴别的研究中。为了挖掘禽类(源性成分)鉴别的分子生物学数据,探讨线粒体不同基因发育信息及鉴别的可信度和灵敏度。本研究扩增鹧鸪线粒体基因组中COⅡ、ATPase8区域,克隆出1138 bp片段,测序结果分析表明,在所克隆的片段中,含有COⅠ基因部分序列、tRNASer基因、tRNAAsp基因、COⅡ基因、tRNALeu基因、ATPase8基因全序列和ATPase6基因部分序列。分析COⅡ、ATPase8和tRNA基因显示其与鹌鹑、鸡、火鸡、鹅、鸵鸟5种禽类的序列均具有较高的同源性,基于它们用MEGA3.1构建系统进化树,探讨了它们所含的信息量及在鹧鸪和其它禽类鉴别方面的应用潜力,发现COⅡ比AT-Pase8和tRNA基因含有更多的鉴别信息。

蛙病毒属PCR检测方法的建立及其在甲鱼“红脖子”病病原鉴定中的应用

在GenBank中搜寻EHNV相关序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列设计引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)的检测方法,扩增蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)410 bp的DNA片段。用该方法从患“红脖子”的甲鱼中分离的病毒毒株(9701株)中扩增出特异性的片段。对扩增产物进行基因克隆、序列测定和序列分析,结果表明该片段和蛙病毒属其他病毒MCP的编码基因同源性都在96%以上,和牛蛙虹彩病毒的基因序列相似性为100%,因此初步判定9701株属于蛙病毒属。

供港活畜可先行建立动物福利制度

广义上的动物福利是指让动物在舒适的环境中健康快乐地生活：狭义的动物福利是指满足动物个体的最适生存条件。具体包括五项基本原则：一是为动物提供保持健康和精力所需的清洁饮水和食物，使动物免受饥渴：二是为动物提供适当的庇护和舒适的栖息场所，使动物免受不适；三是为动物做好疾病预防，并给患病动物及时诊治，使动物免受疼痛和伤病：四是为动物提供足够的空间、适当的设施和同种动物伙伴，使动物自由表达正常行为；五是确保动物拥有避免精神痛苦的条件和处置方式，使动物免于恐惧和悲痛。

浅谈玉米粗缩病的发生及防治

阐述玉米粗缩病的症状，分析玉米粗缩病的发病因素，提出具体的防治措施，以期指导科学防治玉米粗缩病。

试论进出境动植检人才队伍能力建设

人才队伍是进出境动植检工作体系中最活跃的要素,在很大程度上影响着动植检工作的效率和质量。为了加强人才队伍的能力建设,制定科学、统一、规范的培训规划和课程设计,本文以进出境动植检岗位资格管理为基础,构建了4级人才梯队结构,分析了体系平稳运行需把握的3个方面,以新进人员为例介绍了能力提升的做法,以期为全国进出境动植检系统提供有益参考。