鼠伤寒沙门菌效应因子SteA蛋白的表达纯化与晶体培养

目的对鼠伤寒沙门菌效应蛋白SteA进行原核表达与纯化,以期获得高质量蛋白和晶体,为SteA的活性检测及结构解析奠定基础。方法利用生物信息学分析方法,对SteA的氨基酸及核苷酸序列进行分析,了解蛋白性状与序列保守性;使用基因工程方法,将steA基因克隆到原核表达载体pGLO1上;使用大肠埃希菌BL21(DE3)进行SteA蛋白的外源表达;使用镍离子亲和层析,离子交换层析,凝胶过滤层析的方法对SteA蛋白进行体外纯化;使用蛋白结晶试剂盒对提纯的SteA蛋白进行晶体普筛,摸索适合的晶体生长条件并进行优化,培养高质量单晶用于结构解析。结果克隆出SteA全长及SteA 35-173 aa片段基因,并构建了SteA35-173 aa C58S突变体。SteA全长和SteA 35-173 aa C58S蛋白在大肠埃希菌感受态细胞BL21中成功表达,获得了无聚集的SteA蛋白,浓度为7.6 mg/mL。发现在1.2 mol/L Sodium phosphate monobasic/0.8 mol/L Potassium phosphate dibasic;0.1 mol/L CAPS/Sodium hydroxide pH 10.5;0.2 mol/L Lithium sulfate条件下能够获得晶体,条件优化获得可用于数据收集的高质量单晶。结论鼠伤寒沙门菌效应蛋白SteA可在原核表达系统中稳定表达,且可溶性良好,Cys58对SteA二聚体的形成起到重要作用。SteA 35-173 C58S蛋白在磷酸盐和硫酸盐环境中易结晶。

鼠伤寒沙门菌转录调控因子HilD的蛋白纯化及与hilA启动子DNA复合物晶体培养

目的本研究将获取鼠伤寒沙门菌毒力转录调控因子HilD的蛋白,培养HilD蛋白晶体,为进一步分析HilD功能机制和靶向胞内沙门菌药物研发奠定基础。方法以鼠伤寒沙门菌转录调控因子HilD生物信息学分析为基础,使用鼠伤寒沙门菌14028S菌株作为模板进行分子克隆,构建hilD-pGl01重组质粒,使用原核体系表达HilD,通过镍柱亲和层析柱和透析获取纯化蛋白。EMSA实验验证HilD活性。使用晶体培养试剂盒进行晶体培养。结果成功构建了HilD原核表达系统,HilD是一种碱性蛋白,在蛋白提取过程中需要将缓冲液的pH值维持在7.0左右以维持HilD蛋白的稳定性,还需添加2%甘油和2%蔗糖进行保护。hilA能够稳定HilD蛋白,有利于晶体的生长。结论成功获取HilD纯化蛋白,实验证明具有生物活性,培养出HilD与hilA启动子DNA的复合物晶体,复合物的培养为HilD结构解析奠定了基础。