小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子保护多巴胺能神经元的实验

背景:目前尚未见骨髓间充质干细胞对活化的小胶质细胞特异性反应的报道,且有关骨髓间充质干细胞在特定微环境下如何维持多巴胺能神经元的存活也缺乏相应的实验证据。目的:观察骨髓间充质干细胞在活化的小胶质细胞刺激下保护多巴胺能神经元存活的作用。方法:取Wistar大鼠,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,体外培养并活化小胶质细胞,酶消化法培养中脑多巴胺能神经元。实验分为5组:骨髓间充质干细胞组;小胶质细胞组;脂多糖+小胶质细胞组;骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组;分别取各实验组的培养上清,对中脑多巴胺神经元进行培养。单纯多巴胺能神经元组采用体积分数为10%胎牛血清+DMEM/F12进行培养。采用免疫荧光技术检测不同微环境对多巴胺能神经元存活的影响及不同微环境对骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子的影响。结果与结论:含有骨髓间充质干细胞的实验组胶质细胞源性神经营养因子的释放量均较相应的对照组高。酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,单纯多巴胺能神经元组神经元的存活率为15%;小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为10%;骨髓间充质干细胞组多巴胺能神经元的存活率为35%;脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为5%;而骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率达到了28%,高于除骨髓间充质干细胞组外的其他各组(P<0.05)。此外体外培养多巴胺能神经元存活率随培养时间延长下降,但含有骨髓间充质干细胞实验组的多巴胺能神经元存活率明显高于相应对照组。提示小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞上调胶质细胞源性神经营养因子表达,使得多巴胺能神经元免受毒素的损害,抑制了多巴胺能神经元的延迟性死亡。

CXCL12/CXCR4生物学轴对骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的影响

背景:研究发现不同途径移植骨髓间充质干细胞均能向脊髓损伤部位迁移,进而发挥治疗作用。目的:探讨CXCL12/CXCR4生物学轴对骨髓间充质干细胞趋向脊髓损伤部位迁移的作用。方法:采用改进的脊椎骨破坏法制备脊髓损伤模型。假手术组只打开皮肤,不损伤脊髓且不作任何干预;模型组于造模后第2天采用腰骶鞘内注射5μL生理盐水;细胞移植组于造模后第2天采用腰骶鞘内移植5μL骨髓间充质干细胞。结果与结论:①荧光显微镜下可见,横切的脊髓损伤局部有大量的标记细胞聚集,而在损伤部位远端1cm处,仅见少量的标记骨髓间充质干细胞。②骨髓间充质干细胞表达中等水平的趋化因子CXCL12,其特异性结合受体CXCR4也有低水平表达。③脊髓损伤7d后,局部CXCL12表达增强,主要集中在脊髓损伤部位的皮质区域,而在损伤部位1cm以外的脊髓组织未见大量表达的CXCL12。CXCR4蛋白表达没有明显的时间效应。④检测CXCL12mRNA的转录水平发现细胞移植组的CXCR4转录水平明显高于假手术组和模型组,损伤后14d脊髓损伤局部CXCL12的转录水平最强,21d时降低,CXCL12的局部转录水平明显高于远端。⑤脊髓损伤部位也表达趋化因子CXCR4,但其表达水平没有时程差异。损伤局部的CXCR4转录水平略高于远端,但差异无显著性意义。说明CXCL12/CXCR4生物学轴参与骨髓间充质干细胞向脊髓损伤区域迁移。

神经营养因子对体外培养中脑多巴胺能神经元存活和分化的影响

目的观察不同神经营养因子对体外培养中脑多巴胺能神经元（DN）存活和分化的作用。方法选取14d孕鼠,无菌条件下取出胎鼠,采用酶消化法培养中脑DN神经元,在培养过程中,分别加入不同浓度的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、神经营养因子3（NT3）、脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF）,通过细胞形态学和免疫荧光方法进行细胞纯度鉴定,观察不同作用条件下TH阳性细胞率确定细胞存活。结果以10--60ng/L的GDNF或BDNF持续培养10d,中脑多巴胺能神经元的存活率明显高于NGF和NT3作用组,浓度为20ng/m l的GDNF作用最强,能够维持60%的DN神经元存活。此外BDNF和GDNF能够增加DN神经元的数目,但未发现明显的剂量依赖效应,当GDNF与BDNF联合应用时,未见DN神经元的保护作用增强。结论GDNF和BDNF对原代培养的多巴胺能神经元存活具有较强的促进作用,并能诱导神经前体细胞分化为DN神经元。

不同途径移植骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复效果研究

目的观察不同途径移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)对脊髓损伤修复效果。方法选取20g Wis-ter大鼠采用贴壁法分离、培养、纯化BMSCs,选取180gWister大鼠制备脊髓损伤模型动物,分别采用损伤部位和腰骶鞘内两条途径移植细胞,通过BBB评分和细胞形态学方法,观察不同途径移植BMSCs治疗脊髓损伤的效果。结果腰骶鞘内细胞移植后第2、3周进行BBB评分各时间段均较损伤部位细胞移植组评分高。另外形态学观察显示BMSCs经腰骶鞘内移植后组织结构规则,形成明显的网状结构,且组织内空泡数量明显少于BMSCs经损伤部位移植组。结论经腰骶鞘内移植BMSCs的疗效好于经损伤部位细胞移植。

红景天苷与骨髓间充质干细胞联合应用对帕金森病大鼠的治疗作用

目的:研究红景天苷与骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合应用对帕金森病(PD)大鼠的治疗作用,为PD治疗提供实验基础。方法:采用贴壁法培养BMSCs,免疫荧光法检测细胞表面分子。利用MTT法分析10mg·L-1红景天苷对BMSCs增殖分化的影响。将60只大鼠随机分为假手术组、模型组、红景天苷治疗组、BMSCs治疗组、红景天苷和BMSCs联合治疗组,每组12只。在相对应的时间点检测各组大鼠行为学变化,取各组大鼠脑组织测定酪氨酸羟化酶(TH)mRNA表达水平。结果:成功分离提取表达干细胞标志物CD29和CD44细胞。红景天苷作用BMSCs后,BMSCs增殖较对照组更为旺盛且平台期较对照组延长。PD模型组大鼠旋转次数减少,与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05);模型组大鼠行为改变明显,脑组织内TH mRNA表达水平降低。红景天苷和BMSCs联合治疗组大鼠行为学异常程度较轻,脑组织内TH mRNA表达水平高于其他组(P<0.05)。结论:红景天苷与BMSCs联合应用对PD大鼠的治疗作用优于单独应用红景天苷或BMSCs。

红景天苷对BMSC生物学特性影响

目的:研究红景天苷对骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)生物学活性影响。方法:采用贴壁法分离培养BMSCs,检测细胞表面分子表达对所获干细胞进行鉴定。以终浓度为10μg/mL红景天苷与BMSCs共培养,通过形态学观察和MTT法分析研究其对BMSCs生物学特性影响。结果:成功培养出BMSCs,免疫荧光染色显示,培养的第3代BMSCs表达CD29、CD44干细胞标志。10μg/mL红景天苷与BMSCs共培养后,较对照组细胞生长更为旺盛,更为规整,形成典型的"鱼群状"。生长曲线显示,实验组细胞较对照组生长稳定,增殖能力活跃。结论:10μg/mL红景天苷可促进BMSCs增殖分化,又不影响细胞增殖分化等生物学特性。

高海拔地区血液基因组DNA提取条件优化

目的探讨在高海拔地区应用血液基因组DNA提取试剂盒的最佳条件。方法应用RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统,对109份血样(每份血样分为2组,实验组和对照组)提取DNA,实验组采用优化条件提取DNA、对照组采用试剂盒说明书方法提取DNA。结果实验组109份样品中有13份DNA浓度在20-50ng/μL之间,35份在51-80ng/μL之间,61份样品>80ng/μL;DNA浓度比例高于对照组(P<0.05)。实验组109份样品中DNA纯度OD260/OD280比值在≥1.7-<1.9之内的有105份,比值小于1.7的有3份,比值≥1.9的有1份,DNA纯度比例高于对照组(P<0.05)。结论在高海拔地区采用试剂盒提取血液基因组DNA,需要优化提取条件,所得到的DNA浓度和纯度均能满足下游实验要求,且重复性好。

西藏地区92例聋校藏族学生耳聋基因检测结果分析

目的调查藏族儿童和青少年感音神经性耳聋与耳聋易感基因突变的相关性。方法研究对象为西藏自治区聋校的117例藏族耳聋学生，年龄在7～23岁之间；以50例听力正常藏族人群为对照。提取外周静脉血基因组DNA，对DNA浓度及纯度合格的92例样本采用基因芯片检测耳聋基因突变（GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA和GJB3），对有突变的样本进行DNA测序。结果DNA浓度及纯度合格的92份血样，经基因芯片检测，发现4例基因突变，2例为mtDNA12SrRNA1555A〉G均质突变，2例为GJB2杂合突变，突变位点分别为299delAT和235delC。听障组中GJB2的携带率为2．1％（2／92），mtDNAl2SrRNA基因突变率为2．1％（2／92），DNA顺序显示与芯片检测结果一致。50例听力正常的藏族人基因芯片检测未见异常。结论藏族儿童和青少年感音神经性耳聋患者的致聋基因突变与汉族耳聋患者明显不同，推测可能存在其他的致聋基因或者致聋机制。

高山灌木苏嘎纯提取液抑制H_2O_2诱导的角朊细胞凋亡的研究

目的探讨高山灌木苏嘎纯提取液是否具有抗氧化应激作用。方法采用MTT法检测终质量浓度分别为100、50、25 mg/L的苏嘎纯提取液对角朊细胞存活率影响;利用体外培养人角朊细胞系,给予H2O 2处理造成细胞氧化应激模型,采用100mg/L的苏嘎纯提取液预先作用角朊细胞,MTT法检测细胞存活率,并用Annexin V的方法检测细胞凋亡指数。结果通过MTT法检测,发现浓度为100mg/L以下的苏嘎纯提取液对细胞生长没有明显损伤;采用100mg/L的苏嘎纯提取液预处理角朊细胞,使该细胞存活明显增加;经过Annexin V细胞凋亡检测,发现100mg/L的苏嘎纯提取液能够抑制H_2O_2诱导的角朊细胞凋亡。结论苏嘎提取取液具有抑制角朊细胞凋亡,拮抗氧化应激的作用。

骨髓间充质干细胞在造血重建中的作用

目的探讨骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BM-MSC)在造血损伤修复中的作用。方法将同系小鼠股骨、骨壳、注入骨髓条的塑料管及经20Gyγ-射线照射的股骨分别植入同一小鼠腹部皮下,观察1、2、3、4w各移植物造血重建情况。观察髓腔内微循环结构与机能、组织学、分化不同阶段的造血细胞数目与机能等变化,以及骨皮质体外间充质干细胞(MSC)培养与扩增规律。结果乏造血干细胞(HSC)的骨皮质异位移植完全可以造血重建,在移植后4w,移植物已形成完整的封闭的具有正常造血组织的股骨,其重建的程序、速度与具有大量HSC的完整股骨移植的重建基本一致。而经射线破坏和注入塑料管内的骨髓条完全失去造血重建功能。结论骨皮质可能是骨髓MSC的源泉,BM-MSC是造血重建的不可缺少的因素。

以科研促教学 提高人才培养质量

以教学为中心、不断提高教学质量是高等学校人才培养永恒的主题,而科研是提高教学质量的推进器,高校应树立"科研兴教"的理念,只有科研与教学工作密切结合,才能达到教研相长、科研促进教学的目的。只有高水平的科学研究,才能提高学科的水平,才能造就高水平的学术带头人,才能培养学生的创新意识和创新能力,提高人才培养质量。

损伤脊髓匀浆上清对骨髓间充质干细胞分泌髓鞘前脂蛋白、脑源性神经营养因子的影响

背景:损伤脊髓匀浆上清成分复杂,其中不仅存在多种化学物质,而且也存在着多种细胞因子,这些物质能否影响骨髓间充质干细胞的增殖分化和分泌功能还不清楚。目的:探讨损伤脊髓匀浆上清成分对骨髓间充质干细胞分泌的脑源性神经营养因子和髓鞘前脂蛋白的影响。方法:贴壁法分离纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,稳定传到第3代后,分别用正常和损伤的Wistar大鼠脊髓匀浆上清诱导培养20d。免疫荧光染色检测神经元特异性烯醇化酶阳性细胞,ELISA法检测培养液内髓鞘前脂蛋白、脑源性神经营养因子的含量,即时定量-PCR检测髓鞘前脂蛋白mRNA、脑源性神经营养因子mRNA水平。结果与结论:损伤脊髓匀浆上清液诱导培养骨髓间充质干细胞后,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率和培养液内脑源性神经营养因子、髓鞘前脂蛋白的含量在各个时间点均较正常脊髓匀浆上清液对骨髓间充质干细胞培养组高。提示,损伤的脊髓匀浆上清液能够诱导骨髓间充质干细胞分泌脑源性神经营养因子、髓鞘前脂蛋白,有利于向神经细胞方向分化。

大鼠脊髓匀浆上清液对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用

目的探讨大鼠脊髓匀浆上清液对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经样细胞的作用。方法分离得到的MSCs在体外扩增、传代。用碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导后加入不同时间的臂丛神经损伤大鼠脊髓匀浆上清液诱导。免疫细胞化学染色检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,以鉴定分化细胞的表型特征。结果细胞诱导后具有神经元或胶质细胞样细胞的形态,相应细胞表面标志NSE或GFAP阳性,以损伤后7d脊髓匀浆上清液诱导组NSE阳性和GFAP阳性率最高(P<0.05)。结论臂丛根性撕脱伤大鼠脊髓匀浆上清液在体外能够有效地诱导骨髓MSCs分化为神经样细胞,伤后1w可以作为MSCs移植的最佳时间。

贴壁法培养不同龄小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特点

目的观察不同龄小鼠骨髓间充质干细胞在体外分离、培养、扩增的过程,并对其生物学特性进行初步比较分析,为下一步实验提供依据。方法选取出生1周、8周、16周的健康昆明小鼠,分成新生、青年、成年三组,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,进行细胞形态学和贴壁率观察,绘制生长曲线。结果各组细胞约在9-12天80%-90%长满培养瓶底,融合成单层,传代后的骨髓间充质干细胞形态更加单一,为排列更加有序的成纤维细胞样细胞。贴壁率的观察和生长曲线显示,在相同的培养条件下,新生小鼠细胞增殖最快,细胞可扩增能力最强,而成年小鼠细胞增殖最慢,细胞可扩增能力最弱,青年小鼠细胞介于两者之间。结论利用贴壁法可以从不同龄小鼠骨髓中分离出间充质干细胞,并可在体外传代扩增,干细胞的活性和增殖能力随着年龄的增加而降低。

大鼠骨髓间充质干细胞促肝组织损伤修复的作用

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)促肝组织缺血-再灌注损伤修复的作用。为肝脏疾病治疗提供新的思路。方法:①取健康Wistar周龄大鼠的骨髓细胞悬液,进行BMSCs体外扩增培养与分化潜能检测。②健康Wistar成年大鼠随机分为实验组(30只)和对照组(10只)。建立肝组织缺血-再灌注损伤模型,将BMSCs肝局部移植到实验组,对照组移植生理盐水,1周后观察两组肝缺血-再灌注损伤后大鼠的存活率以及肝脏修复情况,并通过蓝色荧光标记观察供体BMSCs在受体内的踪迹,探讨BMSCs促宿主损伤肝组织修复的机制。结果:①分离培养的BMSCs增殖旺盛,纯度较高,且均质性和稳定性好;用诱导剂诱导后,BMSCs具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力。②实验组大鼠成活率达80%,肝细胞逐渐恢复正常,损伤肝组织得到修复,在宿主恢复的肝组织中发现了较多的带有蓝色荧光的细胞存在,而对照组(未移植BMSCs)大鼠腹腔积水、粘连,成活率达30%。2组成活率比较差异有显著性(P<0.05)。结论:BMSCs在体外易分离培养,具有多向分化的潜能;局部移植BMSCs后,可提高大鼠肝组织缺血-再灌注损伤后的恢复。

细胞共培养体系在观察骨髓间充质干细胞对损伤脊髓神经元生长存活影响中的应用

目的:建立细胞共培养体系,观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)对正常及损伤的脊髓神经元的影响。方法:选取新生7d的大鼠,无菌条件下分离骨髓间充质干细胞。选取新生24h的大鼠,无菌条件下分离脊髓背根神经节神经元,并制备机械损伤的模型细胞。用Transwell可渗透培养皿构建共培养体系,通过细胞形态学,免疫细胞化学方法进行细胞纯度鉴定,观察不同条件作用下神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞的存活。结果:共培养组神经元细胞NSE阳性率较相应对照组高。在BMSCs与神经元共培养到第6天,计数神经元的存活率,单纯神经元细胞培养组仅有40%的神经元存活,而共培养组神经元的存活率达到65%。单纯损伤神经元细胞培养组仅有26%的神经元存活,共培养组神经元的存活达到51%,细胞凋亡的数量较对照组明显低。结论:BMSCs可促进正常的脊髓神经元存活,对损伤的脊髓神经元有保护作用,并能诱导神经前体细胞分化为脊髓神经元。

骨髓间充质干细胞移植修复大鼠坐骨神经挤压伤(英文)

背景：骨髓间充质干细胞体外分离培养方便，细胞免疫原性低，更适合于细胞移植，已有证实其在神经缺损修复方面具有较大的应用潜力。目的：明确体外培养的骨髓间充质干细胞体内移植后，促进大鼠周围神经损伤修复的可行性，并初步探讨其可能的作用机制。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-03／2007-03在吉林大学公共卫生学院毒理教研室完成。材料：选取健康雌性Wistar大鼠50只，鼠龄2个月；另选取出生1周的雌性Wistar大鼠6只用于制备骨髓间充质干细胞；实验用兔抗NGF单克隆抗体为Santa Cruz公司产品。方法：①采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，传至第3代，于移植前48h加入BrdU进行标记。②取50只健康Wistar大鼠，利用钳夹法建立坐骨神经挤压伤模型后随机分为细胞移植组和对照组，每组25只，移植组将BrdU标记的骨髓间充质干细胞移植到神经损伤处，而对照组注入等量的DMEM。主要观察指标：①术后1，2，4，6周取移植组损伤段神经进行抗BrdU染色。②术后1，2，4，6周对两组损伤远端神经进行神经生长因子免疫组化染色，图像分析软件分析阳性表达的积分吸光度。③术后每周进行步态分析测量坐骨神经功能指数，术后6周测量再生神经传导速度、坚牢蓝染色后计数有髓神经纤维数目和内径、测量大鼠实验侧腓肠肌湿重和肌纤维横截面积。结果：全部50只实验大鼠均进入结果分析。①术后1,2，4周在细胞移植组神经损伤处可以检测到BrdU阳性细胞。②术后1和2周细胞移植组神经生长因子蛋白表达积分吸光度值均高于对照组，差异有显著性意义（P〈0．01）；而术后4，6周差异则无显著性意义（P〉0．05）。③术后3-6周细胞移植组坐各神经功能指数的恢复要优于对照组；术后6周细胞移植组大鼠的神经传导速度、有髓神经纤维计数和直径、腓肠肌湿重和横截面积均高于／大于对照组，差异有显著性意义（P〈0．05～0．01）。结论：体外培养的骨髓间充质干细胞可进行体内移植，移植后能在局部损伤微环境中发挥作用，促进周围神经损伤修复，提高早期神经生长因子表达是其机制之一。

UVB对角朊细胞的损伤及其机制研究

目的通过UVB照射导致的角朊细胞中丙二醛(MDA)、羟自由基(OH.)和超氧阴离子(O2-)水平的改变和清除这些物质酶类含量和活性的改变,探讨B段紫外线对角朊细胞的损伤作用及机制。方法实验组的角朊细胞用UVB进行照射,对照组细胞用普通日光灯照射。分别测定并比较实验组和对照组细胞产生MDA、OH.和O2-的水平以及两组之间谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶的改变,探讨UVB导致角朊细胞的损伤作用及机制。结果实验组角朊细胞产生的MDA、OH.和O2-的水平显著高于对照组,P<0.05;实验组谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶水平明显低于对照组,P<0.05。结论UVB照射能够导致角朊细胞的氧化损伤,使角朊细胞的的自由基产生增加,使谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶水平明显降低。

骨髓间充质干细胞对大鼠生精上皮不同照射剂量放射性损伤的修复作用

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法,建立大鼠生精上皮放射性损伤动物模型,观察骨髓间充质干细胞对大鼠生精上皮放射性损伤的修复作用。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,建立大鼠放射性损伤动物模型。高剂量(2Gy)放射线照射组Wister大鼠20只,低剂量(0.5Gy)放射线照射组Wister大鼠20只,各组中随机取10只移植骨髓间充质干细胞作为实验组,剩余未移植大鼠10只作为对照组。取10只为经放射线照射大鼠作为正常对照组。照射2周和4周后取大鼠睾丸,切片染色镜下观察。结果高剂量照射组较低剂量照射组大鼠睾丸组织损伤明显加重,低剂量照射组实验组大鼠睾丸组织于移植后两周各级生精细胞基本恢复正常,移植后4周完全恢复与正常未照射组无明显区别。高剂量照射组实验组大鼠睾丸组织于移植后两周管腔内可见少量各级生精细胞,移植后4周管腔内各级生精细胞增多,可见成熟精子。各实验组恢复均好于对照组。结论大鼠骨髓间充质干细胞对生精上皮放射性损伤的修复可起重要作用。