小鼠腹腔巨噬细胞的快速提取及培养

目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞快速提取的方法,为细胞实验提供便捷。方法用生理盐水灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,转入高糖DMEM培养液中培养。采用台盼蓝染色计算存活率,瑞氏染色计算纯度,倒置显微镜观察细胞形态。结果获得较高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征。结论本方法是一种简便实用的提取小鼠腹腔巨噬细胞的方法。

AMPK信号通路在调节小鼠骨髓巨噬细胞抗菌性自噬效应中的作用

目的观察AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)对小鼠骨髓巨噬细胞自噬及杀菌活性的调节作用,并探讨其可能机制。方法分离和体外培养小鼠原代骨髓巨噬细胞(BMDM),观察大肠埃希菌刺激后对BMDM细胞自噬水平及AMPK活化状态的影响。使用AMPK激动剂和抑制剂干预其活化,进一步观察大肠埃希菌感染的BMDM细胞中AMPK活化、自噬水平以及杀菌能力的变化。结果大肠埃希菌感染后的小鼠BMDM细胞自噬相关分子LC3B和Beclin1的表达显著升高,同时LC3Ⅱ/Ⅰ比值也明显升高,且其AMPK的磷酸化水平也随之显著上调。AMPK活性增强后,能够进一步上调BMDM细胞的自噬水平以及对细菌的降解清除。而AMPK活性被抑制后,细胞自噬水平和杀菌活性均显著下降。结论 AMPK分子及其相关信号通路可能在调节巨噬细胞自噬水平以及抗菌效应方面发挥重要作用。

青蒿琥酯通过活性氧自噬途径增加小鼠巨噬细胞杀菌活性

目的研究青蒿琥酯(artesunate,AS)通过增加小鼠巨噬细胞的自噬水平进而上调其杀菌活性的药理作用及机制。方法分离及体外分化培养获得原代小鼠骨髓巨噬细胞。细菌计数实验分为大肠埃希菌(E.coli,EC)组、EC+AS组和EC+AS+抑制剂组(3-MA和Ly294002),建立EC感染细胞模型,给予AS和抑制剂处理,采用平板培养法检测胞内活菌数量。自噬和活性氧检测实验分为medium组、AS组、AS+自噬抑制剂组和AS+活性氧清除剂组[还原型谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)],RT-PCR和Western blot法检测自噬体标志物的表达,荧光探针法检测胞内活性氧水平。结果经定向分化后,获得形态良好的原代巨噬细胞。细菌计数实验结果显示,与EC组比较,EC+AS组细胞胞内EC数量显著减少(P<0.01),且具有剂量和时间效应关系。EC+AS+自噬抑制剂组和EC+AS+活性氧清除剂组细胞胞内细菌较EC+AS组显著升高(P<0.01)。自噬和活性氧检测结果显示,AS组较medium组自噬基因LC3B和Atg5的mRNA和蛋白表达均明显升高,且具有剂量效应关系(P<0.01)。AS+自噬抑制剂组或AS+活性氧清除剂组自噬蛋白的表达较AS组明显降低,AS+活性氧清除剂组ROS水平较AS组也显著降低(P<0.05)。结论青蒿琥酯能够增加巨噬细胞的杀菌活性,且该作用与其上调细胞活性氧水平,进而激活细胞自噬效应有关。

替来他明和唑拉西泮复合麻醉对比格犬生理及血气指标的影响

目的观察比格犬经替来他明和唑拉西泮复合麻醉前后的心率、体温、血压以及血气的变化规律,为应用比格犬进行研究提供有关麻醉剂影响动物检测指标的实验数据。方法实验选用替来他明和唑拉西泮(1∶1)稀释后肌肉注射(10 mg/kg)对比格犬行全身麻醉,麻醉前、后分别采集动脉血,通过血气分析仪检测血气指标,同时应用大动物心电监护仪测定比格犬麻醉前后生理指标(心率、血压、体温)。结果比格犬经替来他明和唑拉西复合麻醉后,动脉血气指标中p H显著降低,差异具有极显著性统计学意义(P<0.01);PCO2显著升高,而PO2显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05);Lac和HCO3-无明显变化,表现为明显的呼吸性酸中毒。生理指标中血压变化无统计学意义。心率明显升高,体温明显下降,差异均具有极显著统计学意义(P<0.01)。上述指标在性别间比较差异均无统计学意义。结论采用替来他明和唑拉西泮复合麻醉比格犬,可引发呼吸抑制和气道堵塞等现象,导致呼吸性酸中毒的发生,同时还可引起心率升高和低体温的发生。在实验过程中要注意保暖和保持呼吸畅通,在进行动物指标差异比较时要考虑麻醉剂的影响。

血必净注射液对脓毒症模型大鼠急性肺损伤的保护作用及机制研究

目的：观察血必净注射液对盲肠结扎穿孔（CLP）模型大鼠急性肺损伤的保护作用。方法：采用死亡率为30-50％的大鼠CLP模型，将S-D大鼠随机分为假手术组，CLP模型组、常规治疗组和血必净治疗组。各组分别于CLP术后12、24、48和72h处死取材。

CpG-c41对TLR9信号通路的干扰作用及其机制探究

目的探讨Cp G-c41分子对TLR9信号通路的干扰作用及其机制。方法获取小鼠骨髓巨噬细胞,M-CSF刺激使骨髓细胞向单核巨噬细胞分化,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测诱导成功的巨噬细胞的比例;培养Raw264.7细胞,ELISA法检测Cp G-c41分子对TLR9激动剂Cp G-1826刺激小鼠来源骨髓巨噬细胞和Raw264.7细胞诱发的炎症因子TNF-α和IL-6的影响;Western blot检测Cp G-c41对TLR9-My D88依赖型信号通路中磷酸化NF-κB蛋白表达的影响;ELISA法检测非Cp G-ODN分子对Cp G-1826刺激Raw264.7细胞诱发的炎症因子TNF-α和IL-6的影响;免疫荧光检测Cp G-c41与TLR9的共定位情况以及Cp G-c41对Cp G-1826与TLR9结合的影响。结果 Cp G-c41抑制Cp G-1826诱导的炎症因子TNF-α和IL-6的释放(P<0.01);Cp G-c41抑制TLR9信号通路中NF-κB的磷酸化表达;非Cp G-ODN不影响Cp G-1826诱导TLR9释放TNF-α和IL-6;Cp G-c41通过与TLR9竞争性结合抑制Cp G-1826与TLR9识别。结论 Cp G-c41通过竞争性结合TLR9干扰TLR9-My D88信号通路的活化。

PAMPs对抗体诱导类风关样小鼠模型的影响

目的探讨病原相关模式分子（PAMPs）对抗体诱导的关节炎（CAIA）样小鼠模型建立的影响。方法 7~8周龄Balb/c雌鼠,第0天使用抗体混合物诱导,第3天使用LPS（TLR4激动剂）或Cp G ODN 1826（TLR9激动剂）激发,每天定时观察四肢关节发病情况并进行关节评分;小鼠腹腔注射O111：B4和O55：B5,绘制生存曲线进行毒性分析;ELISA检测PAMPs刺激小鼠巨噬细胞后IL-6、TNF-α的分泌水平;鲎实验定量检测相同浓度下O111：B4和O55：B5的有效活性。结果 PAMPs成功激发CAIA模型炎症,其中O55：B5低死亡率、高成模率;O111：B4的毒性强于O55：B5;O55：B5的炎症因子分泌量显著高于O111：B4和Cp G ODN 1826（P〈0.01）;O111：B4的有效活性显著高于O55：B5（P〈0.01）。结论低毒高致炎性的O55：B5激发模型效果最佳,说明PAMPs能够影响建模效果,而低毒高致炎性PAMPs适合该模型的激发。

小鼠烧伤创面脓毒症模型的建立与评价

目的建立一种稳定的小鼠烧伤创面脓毒症模型,检测其病理生理指标,为烧伤脓毒症相关研究提供标准化的动物模型。方法将小鼠背部侵入90℃水面接触8 s建立小鼠Ⅲ度烫伤模型,烫伤面积约15%~20%。2 h后痂下注射100μL浓度为0.75×10^(5) CFU/mL的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)造伤后创面脓毒症。连续12 d观测记录小鼠的体重、采食量、生存率和一般状态指标。在注射后1、2、3、5、7 d取小鼠外周血和肝组织,测定血清生化和炎症因子指标,观察肝组织病理改变。结果模型组建模后12 d的死亡率为30.2%。血清生化指标中ALT、AST、UREA和CREA均较建模前显著上升(P<0.05或P<0.01),TP和TBIL指标无明显变化。血清炎症指标中TNF-α、IL-6在建模后第1天升至最高值(P<0.01),随后逐日递减,分别至第3、7天恢复至造模前水平。肝组织病理切片结果显示在各个时相点均出现肝损伤表现。结论建立了操作简便可控、严重程度适宜的烧伤脓毒症模型,符合烧伤脓毒症的病理生理特点,可为相关机制研究和药物研发提供标准化的实验动物模型。

一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法

目的在传统肝细胞提取方法的基础上,优化一种易操作、快速实用获取小鼠肝细胞的方法,为从事肝脏功能相关研究人员提供改良的实验方法参考。方法以肝脏分离液逆向灌注小鼠肝脏后,剪碎,肝脏酶消化后密度梯度离心分离肝细胞,转入培养基培养。采用台盼蓝染色计算细胞活力,流式细胞检测技术计算纯度,倒置显微镜观察细胞形态。结果获得较高纯度和活力的肝细胞,具备肝细胞的典型形态特征。结论通过逆向灌注,降低了灌注的难度,同时获得较高纯度、较高活力的肝细胞,经多次实验证明该方法确实是一种易操作、高效适用的肝细胞提取方法。