助阳舒心方对抑郁模型大鼠HPA轴调控机制的研究

目的:探讨助阳舒心方对抑郁模型大鼠HPA轴调控的机制。方法:采用慢性轻度不可预见性刺激(CUMS)结合孤养建立大鼠抑郁模型,将60只雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、盐酸氟西汀组及助阳舒心方低、中、高剂量组,观察助阳舒心方对大鼠体质量及糖水消耗的影响;运用逆转录聚合酶联反应(RTPCR)法检测大鼠下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、糖皮质激素受体(GR)和垂体阿黑皮素原(POMC)mRNA表达情况。结果:助阳舒心方可逆转慢性应激大鼠体质量减轻、糖水消耗减少,下调下丘脑CRH和垂体POMC mRNA表达,上调下丘脑GR mRNA表达。结论:助阳舒心方对慢性应激大鼠具有抗抑郁作用,其调控HPA轴的机制与下调下丘脑CRH、垂体POMC mRNA表达和上调下丘脑GR mRNA表达有关。

Cyr61真核表达载体构建及在人原代培养软骨细胞中的表达研究

目的通过体外原代培养获得人软骨细胞,将重组真核表达载体pcDNA3.1-cyr61转染人软骨细胞,探讨外源性cyr61在软骨细胞中的表达效应。方法应用机械分离联合胶原酶消化法,原代培养获得人软骨细胞,镜下观察及扫描电镜分析软骨细胞形态,Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)免疫细胞化学及甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞表型;构建pcDNA3.1-cyr61真核表达载体,Fugene介导转染人软骨细胞,Western blot验证其表达效应;RT-PCR检测重组质粒转染后软骨细胞CollagenⅡ、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)基因mRNA表达改变。结果Ⅱ型胶原免疫细胞化学、甲苯胺蓝染色及形态学分析证实原代培养获得的细胞为人软骨细胞;酶切与DNA测序显示pcDNA3.1-cyr61重组质粒成功构建,Western blot检测表明外源性cyr61重组质粒能有效表达于人原代软骨细胞,且目的蛋白cyr61表达水平较空白组细胞明显升高;cyr61重组质粒转染软骨细胞后其CollagenⅡ、AggrecanmRNA表达呈明显增高。结论 Cyr61蛋白在人原代培养软骨细胞中呈表达缺失,外源性cyr61基因能有效表达于人软骨细胞,并且能增加软骨细胞CollagenⅡ、Aggrecan基因的mRNA表达,为进一步利用cyr61基因修饰软骨细胞增强其生物学功能奠定基础。

平阳霉素对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926的作用及其机制

目的:观察平阳霉素(PYM)对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926的作用及可能机制。方法:采用甲基三氯硅烷(MTS)比色法检测PYM对EA.hy926细胞体外生长的作用;流式细胞术测定PYM作用细胞24h后细胞凋亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表达、线粒体膜电位的变化;免疫印迹(Western-blot)法检测PYM对EA.hy926细胞中Caspase-8、Caspase-9蛋白表达水平的影响。结果:PYM可明显抑制EA.hy926细胞的增殖,且生长抑制率具有浓度时间依赖性;流式细胞术检测结果显示PYM各浓度作用24h后,细胞凋亡百分率随药物浓度增加而增高,活化Caspase-3表达在PYM各浓度组均增强,线粒体膜电位在各浓度组均下降;Western-blot法检测结果显示PYM作用EA.hy926细胞后,Caspase-8、Caspase-9蛋白均可出现明显的剪切带。结论:PYM能抑制EA.hy926细胞的增殖,这种抑制作用是可通过诱导细胞凋亡实现的,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9参与了PYM诱导EA.hy926细胞凋亡的过程。

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定

目的建立一套简单易行有效的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养、纯化、鉴定的方案,初步了解BMSCs的基本性状和功能特点。方法取4周龄雄性SD大鼠,全骨髓贴壁培养BMSCs,对细胞相关的性状进行观察及分析,流式鉴定表面抗原,诱导其成骨、成脂分化,并进行染色鉴定等。结果流式检测结果 CD29、CD90呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应,成骨诱导分化后茜素红染色呈阳性反应,成脂诱导分化后油红染色呈阳性反应。结论全骨髓培养法是一种相对简单易行的BMSCs分离纯化的方法,可获得纯度高,活性好,性状均一的BMSCs。

确炎舒松对骨髓间充质干细胞的影响

目的了解不同浓度确炎舒松对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)形态、增殖、凋亡、分化等生物学特性的影响。方法采用全骨髓贴壁培养BMSCs,选取第3代(P3)大鼠BMSCs,以不同浓度确炎舒松进行干预,观察细胞形态变化,检测生长活性、凋亡率以及成骨分化能力等的变化。结果本实验成功分离培养骨髓间充质干细胞,试验中随着药物浓度的升高,BMSCs形态发生变化,生长活性逐渐受到抑制,细胞凋亡比率升高,且确炎舒松成骨诱导21天后,茜素红染色呈阳性反应。结论确炎舒松对BMSCs生长活性及凋亡有明显影响,且其影响呈浓度依赖性,一定浓度确炎舒松可促进BMSCs成骨分化。

肝内胆管结石与ApoAⅠ-CⅢ-AⅣ基因PstⅠ位点多态性的关系研究

目的探讨载脂蛋白AⅠ-CⅢ-AⅣ(apolipoprotein AⅠ-CⅢ-AⅣ,Apo AⅠ-CⅢ-AⅣ)基因PstⅠ位点多态性与肝内胆管结石易感性(the happening of hepatolithiasis)的关系。方法应用PCR和限制性内切酶技术对64例肝内胆管结石患者和120例正常人Apo AⅠ-CⅢ-AⅣ基因PstⅠ位点进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms,RFLP)分析。结果肝内胆管结石组中A1A1、A1A2、A2A2基因型频率分别为0、4.7%、95.3%,正常对照组中A1A1、A1A2、A2A2基因型频率分别为0、10.0%、90.0%。肝内胆管结石组和正常对照组各基因型频率的比较(χ2=1.599,P=0.206)和等位基因频率的比较(χ2=1.531,P=0.216)差异均无统计学意义。结论 Apo AⅠ-CⅢ-AⅣ基因PstⅠ位点多态性可能不是肝内胆管结石的危险因素。

白介素-18基因启动子区rs1946519位点多态性与不明原因复发性流产的关系研究

目的探讨浙江地区汉族人群人白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）基因启动子区rs1946519位点多态性的分布及与不明原因复发性流产易感性的关系。方法选取135例不明原因复发性流产患者，提取基因组DNA，应用PCR和基因测序法测定IL-18基因rsl946519位点的多态性情况，并以126例健康妊娠女性为对照。结果不明原因复发性流产组人群IL-18基因rsl946519位点AA、AC、CC基因型的分布频率分别为27．4％、38．5％和34．1％，而健康妊娠的对照组人群AA、AC、CC3个基因型的分布频率分别为19．0％、58．7％和22．2％，两组间差异有统计学意义（r=10．693，P=0．005）；其中突变后纯合子cc基因型在不明原因复发性流产组的分布频率明显高于对照组，且两组间差异有统计学差异（X2=4．507，P=0．034；OR：1．809，95％CI：1．043～3．137）。另，不明原因复发性流产组rs1946519位点A、C等位基因频率分别为48．4％、51．6％，与对照组（46．7％、53．3％）比较，两组间差异无统计学意义（X2=0．159，P=0．690）。结论IL-18基因rs1946519位点基因型分布频率在不明原因复发性流产患者和健康妊娠女性中存有差异，CC基因型可能是不明原因复发性流产的易感基因型。

Tim-3基因rs10053538、rs10515746位点多态性与原因不明复发性流产的关系

目的探讨Tim-3基因启动子区rs10053538、rs10515746位点多态性与原因不明复发性流产的关系。方法收集148例原因不明复发性流产患者为研究对象,以153例正常妊娠者为对照。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法和特异性等位基因聚合酶链反应(AS-PCR)法分别检测rs10053538、rs10515746位点多态性,并取部分PCR产物作测序验证。结果原因不明复发性流产患者rs10053538位点GT+TT基因型及T等位基因分布频率(10.1%和5.1%)与对照组(11.8%和6.5%)比较差异无统计学意义(χ2=0.205,P=0.651;χ2=0.592,P=0.441)。rs10515746位点GT+TT基因型频率及T等位基因分布频率(6.8%和3.4%)与对照组(3.9%和2.0%)比较差异均无统计学意义(χ2=1.201,P=0.273;χ2=1.169,P=0.280)。结论 Tim-3基因启动子rs10053538、rs10515746位点多态性与原因不明复发性流产可能无相关性。

正常人关节软骨细胞的培养及冻存复苏的影响

目的观察正常人关节软骨细胞的体外培养及冻存后再复苏对人体关节软骨细胞活性所产生的影响。方法在无菌条件下取因创伤所致离断且无再植条件残肢的关节软骨组织,采用Ⅱ型胶原酶一次消化的方法获取原代软骨细胞后进行体外培养,并经10%DMSO冻存液冻存及常规复苏,过程中均用倒置显微镜定期观察软骨细胞的形态生长变化以及复苏后细胞的存活率。结果常规消化传代后的第2～4代间贴壁时间无明显差别,但较原代明显变短,生长速度加快,在形态上仍以三角或多角形为主,传代在5代以内的软骨细胞仍能保持正常的组织学形态,且复苏后软骨细胞的存活率能达95%。结论原代培养获得的正常人体关节软骨细胞在5代以内者可以较好地保留软骨细胞的特性和活性。

双氯芬酸钠对大鼠骨髓间充质干细胞的影响

目的研究不同浓度双氯芬酸钠对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)形态、增殖、凋亡、分化等生物学特性的影响。方法采用全骨髓贴壁分离、培养BMSCs,选取第3代细胞,以不同浓度双氯芬酸钠进行干预,观察细胞形态变化,检测生长活性、凋亡率以及成骨分化能力等。结果成功分离培养BMSCs。随着加入双氯芬酸钠浓度的升高,BMSCs形态发生变化,生长活性逐渐受到抑制,细胞凋亡率升高,且成骨诱导21 d后,钙结节数随浓度的升高而减少。结论双氯芬酸钠可影响BMSCs的生长活性、凋亡及成骨分化能力,且呈浓度依赖性。