4株SARS冠状病毒中国分离株3′非编码区的序列测定及分析

分别对 4株SARS冠状病毒中国株基因组 3′非编码区序列进行测定和分析 ,然后应用Blast、DNAstarGeneQuest等软件对中国株的这段序列与其它SARS和非SARS冠状病毒的序列进行比较 .结果显示 ,所测 4株SARS冠状病毒中国分离株的 3′非编码区长度均为 339nt,与其它已测序SARS冠状病毒的相应序列完全一致 .SARS冠状病毒的非编码区含有冠状病毒保守的“伪结”结构 .在距末端 138nt处还存在 1个长约 32nt的Ⅱ型茎 环结构的序列 ,该序列在其它已知人冠状病毒中并不存在 ,而与禽传染性支气管炎病毒和星状病毒中的对应序列高度同源 .

长链PCR技术研究进展

长链PCR(longPCR)技术是将传统DNA聚合酶与具有 3′ 5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶混合 ,利用前者较强的延伸能力和后者的校正功能 ,通过优化反应液组成及热循环条件 ,能够扩增出长达 4 0kb的特异产物 ,在病毒基因组研究及基因检测等方面显示出很好的应用前景。本文就长链PCR技术的原理。

非典型肺炎病例标本中新型冠状病毒的分离与鉴定

目的 对非典型肺炎的病原体进行分离鉴定 ,为该病的诊断、预防和治疗提供依据。方法 采用细胞培养和乳鼠接种法 ,从非典型肺炎病例标本中分离致病病原体 ,通过电镜形态学、血清学和动物致病性观察及RT PCR扩增与部分基因序列分析 ,对分离的病原体进行鉴定。结果 成功地从死亡病例尸解的肺组织标本和患者鼻咽拭子标本中采用细胞培养法分离出病原体。通过电镜在病变细胞及其培养上清中观察到大量冠状病毒样颗粒。免疫荧光染色检测非典型肺炎患者血清 ,表明分离的病毒与此次流行的非典型肺炎密切相关。分离的病毒可对乳鼠致病 ,并在发病乳鼠的肺组织标本中通过电镜同样观察到冠状病毒样颗粒。从非典型肺炎病例尸解肺组织、传代发病小鼠肺组织及分离物感染的细胞培养物中 ,通过RT PCR可分别扩增出冠状病毒的cDNA片段 ,测序结果显示其核苷酸序列与已知冠状病毒的同源性在 6 0 %左右。结论 从非典型肺炎病例标本中已成功分离出一种新的冠状病毒 ,它与此次流行的非典型肺炎密切相关 。

新分离的冠状病毒与严重急性呼吸综合征病原关系的研究

目的 确定新分离的冠状病毒与目前流行的严重急性呼吸综合征的病原关系。方法 以用细胞培养法从严重急性呼吸综合征病例标本中分离出的冠状病毒为抗原 ,通过免疫荧光染色及中和试验测定严重急性呼吸综合征患者血清中抗新分离的冠状病毒的抗体 ,分析确定新冠状病毒与严重急性呼吸综合征的病原关系。结果 在临床确诊的 1 1 3份严重急性呼吸综合征患者血清标本中 ,99份检测出有抗新冠状病毒的抗体。 1 0对双份血清检测结果显示 ,后采集的血清抗体效价均比发病初期采集的明显增高 ,最高的升高 1 2 8倍。中和试验结果证明 ,病人血清抗体能够中和新分离的冠状病毒。结论 新分离的冠状病毒与此次流行的严重急性呼吸综合征密切相关 。

我国D2-43病毒株PrM-E基因的重组SFV的制备及生物学鉴定

为构建含PrM E基因的重组SFV病毒 ,将含我国登革 2型病毒PrM E基因的SFV表达载体和辅助载体DNA线性化后 ,进行体外转录 .然后将获得的 2种RNA转录物共转染BHK2 1细胞 ,以RT PCR法证明转染后的细胞培养上清中含有重组SFV .进一步将该重组病毒经蛋白酶激活后可使BHK2 1细胞产生细胞病变 ,并且以间接免疫荧光法在感染细胞内可检测到登革 2型病毒所特有的蛋白 .含我国登革 2型病毒PrM E基因的重组SFV的获得 ,为进一步观察该重组病毒的免疫原性奠定了基础 。

我国登革2/4型病毒株Pr-M-E基因的双表达质粒构建及在真核细胞中的共表达

将我国登革 2、4型病毒分离株PrM E基因通过RT PCR以病毒RNA为模板扩增我国登革 2型 4 3株和 4型B5株的PrM E基因 .并分别克隆至pGEM TEasy载体 ,然后亚克隆至双顺反子表达质粒的两个多克隆位点 ,获得同时含有登革 2型 4 3株和 4型B5株PrM E基因的双顺反子重组表达质粒pIDME2 4 .在用该重组质粒转染的BHK2 1细胞中 ,不但可检测到PrM E基因的转录产物 ,而且采用间接免疫荧光法还可观察到针对登革 2型 4型病毒的特异荧光 .研究结果表明 ,重组的双顺反子表达质粒在真核细胞中可共表达登革两个血清型PrM E基因 。

SARS病毒BJ01株空斑测定方法的建立

目的 建立SARS病毒空斑测定方法 ,为SARS病毒生物学研究提供手段。方法 将不同稀释度SARS病毒BJ0 1株分别接种Vero细胞单层 ,然后加营养琼盖。按DullbeccoR的方法计算空斑滴度。结果 SARS病毒BJ0 1株加营养琼盖后 ,3天即可出现空斑 ,形态呈圆形 ,直径 2 .5～ 3mm ,大小均匀。结论 建立的SARS病毒的空斑方法稳定 。

我国登革3型病毒广西80-2株基因组全序列分析

对我国登革 3型病毒 80 2株基因组进行全序列测定 ,为了解其基因组结构与功能的关系提供依据 .根据登革 3型病毒H87株的序列设计并合成引物 ,应用RT PCR和RACE法 ,对 80 2株基因组RNA进行扩增、克隆测序后获得我国登革 3型病毒广西株基因组序列 .该株病毒基因组全长10 696nt ,不含poly(A)尾 ,4种碱基数分别为A :3 4 3 7,C :2 2 15,G :2 773 ,U :2 2 71.包含一个读码框架 ,自 95至 10 2 67位 ,共 10 170个碱基 ,编码 3 3 90个氨基酸 ,5′和 3′非编码区长度分别为 94nt和4 3 2nt.与H 87株比较 ,核苷酸和氨基酸序列同源性均在 99%以上 ,有 2 8个碱基发生改变 ,其中 2 6个碱基突变发生在读码框架内 ,碱基转换 18个 ,颠换 10个 ;碱基突变引起 14个氨基酸的改变 .80 2株与H87株病毒的基因组全序列同源性高 ,变异度小 .

我国两株登革2型病毒基因组的全序列分析

本研究对我国两株登革２型病毒Ｄ２－４３株、Ｄ２－０４株的基因组进 行 了全序列测定，在此基础上对这两株引起不同临床症状及鼠神经毒力的登革病毒的基因组序 列进行了比较分析，结果表明Ｄ２－４３株与Ｄ２－０４株基因组全长约为１０ ７２３ｎｔ，核苷酸序列的同源性为９５．１％，氨基酸序列的同源性为９７．６％， 不存在特别的高变区。这两株序列中共有８３个核苷酸的变化导致了氨基酸的变化，其中２１个 差异氨基酸可引起所在位点电荷或极性的变化，位于登革病毒粒子表面的Ｅ糖蛋白第１２６位氨 基酸由Ｇｌｕ （Ｄ２－０４株）→Ｌｙｓ（Ｄ２－４３株）的变化对其抗原性有影响，可能引起了病毒对鼠神 经 毒力的改变。对结构糖蛋白Ｅ基因的聚类分析表明Ｄ２－４３株与新几内亚株、台湾８７株及菲律 宾 ８３株亲缘关系较近，Ｄ２－０４株与牙买加株及巴西９０年分离株的亲缘关系较近，表明我国存 在不同起源的登革２型病毒感染。

两种甲病毒基因组序列的一步RT-PCR检测

目的 通过对不同扩增条件的优化 ,建立两种马脑炎病毒的快速RT -PCR检测方法。方法 根据东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒基因组相应序列设计引物 ,然后采用两步法及两种一步法分别对其基因组序列进行RT -PCR扩增 ,并用琼脂糖凝胶电泳进行观察。结果与结论 三种方法均可从两种马脑炎病毒感染的乳鼠脑和细胞上清中扩增出单一的DNA片段 ,其大小与预期的相一致。与其他两种方法相比 ,本研究所建立的一步法更为简便快速、价格低廉 ,为进一步组装这些病毒的检测试剂盒奠定了基础。

西尼罗病毒的RT-PCR检测与鉴定

建立西尼罗病毒敏感、特异、快速的RTPCR检测方法用于实验室诊断和流行病学监测。采用一步RTPCR和套式PCR法对西尼罗病毒感染的乳鼠脑和细胞培养上清进行扩增,并对扩增产物进行序列测定。两种方法均可分别从两种组织中扩增出与预期大小相一致的片段,套式PCR法比一步RTPCR法更为敏感,该扩增片段与西尼罗病毒埃及Eg101株相应序列的同源性为99%。

SARS灭活疫苗对猴体的免疫原性及保护效果观察

观察SARS灭活疫苗对猴体的免疫原性及保护效果 ,为进一步的临床研究奠定基础 .将BJ0 1株SARS病毒感染的Vero细胞的培养液过滤澄清 ,经 β 丙内酯灭活和超滤浓缩 ,然后经凝胶过滤和离子交换层析获得纯化的SARS灭活疫苗 .经HPLC分析其纯度为 97.6 % ,在电子显微镜下可观察到SARS病毒样颗粒 .蛋白质印迹 (westernblotting)分析表明 ,纯化SARS灭活疫苗可与SARS患者恢复期血清起反应 .纯化的SARS灭活疫苗符合有关的质量标准 .用SARS灭活疫苗免疫猴体可产生高效价的中和抗体 ,可阻止SARS病毒在猴体内增殖 ,且对SARS病毒攻击具有保护作用 .在低中和抗体情况下 ,用SARS病毒攻击免疫猴后没有出现感染增强现象 .猴体免疫SARS灭活疫苗后 ,无论正常剂量还是大剂量疫苗免疫 ,均未发现局部和全身副反应 。

我国登革3型病毒广西株基因组非编码区结构特征的研究

应用cDNA末端快速扩增法 (RACE) ,获得我国登革 3型病毒株基因组的包括 5′和 3′端非编码区的扩增片段 ,经琼脂糖凝胶电泳观察其长度分别为 710bp和 470bp。序列分析表明 ,与登革 3型病毒菲律宾株 (H87株 )核苷酸序列同源性 >99%。进化树分析提示 ,该株病毒属于登革 3型病毒Ⅰ亚型。基因组的 5′和 3′端可能含有较强的二级结构域。

国内首次自患者标本中同时分离的登革2型和3型病毒的鉴定

采用间接免疫荧光方法 ,检测患者血清标本中的抗登革病毒IgM和IgG抗体 ;同时将病人急性期血清接种C6 36细胞进行病毒分离。从分离的病毒悬液中提取RNA ,进行RT PCR扩增和序列测定。结果显示 ,该患者血清中存在抗登革病毒的IgM和IgG抗体。从病人血清中分离的病毒 ,经RT PCR和序列测定证实为登革 2型和 3型病毒的特异序列。表明该患者为登革 2型和

我国D2-43株PrM-E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性研究

目的通过观察含我国登革2型病毒株D2-43的PrM-E基因的复制型SFV重组质粒DNA的免疫原性,为登革新型疫苗的研制提供依据。方法将PrM-E基因自T载体上切下,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中。将此重组质粒DNA以电穿孔法导入BHK21细胞,表达产物的特异性用间接免疫荧光法进行鉴定。采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA,然后以不同剂量通过肌肉注射途径免疫Balb/c鼠,鼠血清中的抗体用间接免疫荧光法进行检测。结果含PrM-E基因的重组SFV质粒DNA在BHK21细胞中可表达登革2型病毒的特异蛋白;经免疫Balb/c鼠后,鼠血清可与登革D2-43感染的C6/36抗原片起特异的抗原抗体反应。结论含登革2型病毒PrM-E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb/c鼠中可诱导登革2型病毒特异抗体的产生,但抗体水平较低。

登革2型型内嵌合病毒全长cDNA克隆的构建

运用OL PCR(OverlapPCR)方法 ,扩增出D2 0 4和D2 MON5 0 1结构蛋白区、5′非编码区等区域的嵌合片段 ,以此片段替换 pDVWS5 0 1质粒中的相应部分后 ,转化DH5α菌。测序结果表明 ,已成功构建含有D2 0 4株完整的PrM和E基因、一部分C基因 ,及D2 MON5 0 1株非编码区、非结构蛋白区和大部分C基因的嵌合病毒全长cD NA(QH 0 4/MON5 0 1)克隆。为进一步研究登革

登革病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达及其自组装活性的研究

采用高保真RT-PCR自登革2型病毒43株基因组RNA中扩增全长C基因及缺失羧基端Cv片段,分别构建可表达C及Cv的重组质粒pLEX-C和pLEX-Cv,转化E.coliGI724后用色氨酸诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达的C及Cv蛋白相对分子质量分别约为12000和10000,分别约占菌体蛋白总量的19%和13%。Western印迹检测表明重组表达的C蛋白均可被特异识别登革病毒衣壳蛋白的单克隆抗体特异识别。表达的蛋白经过硫酸铵沉淀和蔗糖密度梯度离心后,通过琼脂糖凝胶电泳和负染电镜均未能检测到衣壳样颗粒的存在,说明登革病毒衣壳蛋白可能不具体外自组装活性。

SARS病毒BJ01株核壳蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

通过RTPCR从SARS病毒BJ01株的RNA中扩增全长N基因,经凝胶回收后插入pBAD/TOPOThioFusion表达载体。然后在Top10中利用阿拉伯糖进行诱导表达,在优化的条件下,表达产物以可溶性为主,表达量约占细菌可溶性总蛋白的47%。表达产物采用ProBond蛋白纯化系统纯化后,目的蛋白约占67%。经免疫印迹法检测,表达产物与SARS病人恢复期血清和兔的抗血清均可进行特异反应。BJ01株核壳蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达为后续的ELISA试剂盒的研制奠定了基础。

二元生物薄标样的制备技术方法

本文着重介绍,在电镜X射线微区分析工作中,如何建立二元生物薄标样的制备技术方法,以及相关的计算公式等。

登革2型PrM基因的重组病毒对不同型别登革病毒复制的阻断作用

观察登革 2型PrM基因的pSFV重组甲病毒抗该型病毒的作用 ,进一步探讨登革 2型PrM基因的这种重组病毒对其它 3个血清型登革病毒复制的阻断作用 .采用体外转录和电穿孔 ,分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒 .再将激活的重组病毒感染细胞 ,分别用不同型病毒进行攻击 .然后通过免疫荧光法 ,观察对登革病毒复制的阻断作用 .结果表明 ,含登革 2型PrM基因的重组病毒不仅可阻断登革 2型病毒的复制 ,同样具有抑制其他 3个型病毒复制的能力 ,且抗登革 1、4型病毒的复制作用强于抗登革 3型病毒的作用 .用 10 3 TCID50 剂量的登革病毒攻击 ,含反义PrM基因的重组病毒可完全阻断登革 1、3、4型病毒的复制 .但含正义PrM基因的重组病毒对登革 3型病毒的复制不能完全阻断 .