C8orf4基因编码蛋白对猪流行性腹泻病毒体外复制的抑制效应

C8orf4,也称为甲状腺癌1(thyroid carcinoma 1,TC1),最初是从甲状腺癌及其周围正常甲状腺组织克隆而来,在脊椎动物中普遍表达,具有跨物种的序列保守性。研究表明,C8orf4在肿瘤中高表达,参与各种癌细胞间信息通讯,是一种与癌症和炎症有关的新型调节因子,并通过调节NF-κB的转录增强炎症反应,但对病毒的影响知之甚少。为研究C8orf4编码蛋白对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)复制的影响,将PEDV接种于Vero细胞,通过qRT-PCR和Western blot检测不同时间点PEDV对C8orf4表达的影响;设计并合成表达C8orf4基因的真核表达载体pcDNA3.1-C8orf44-His和特异性siRNA,通过过表达和抑制C8orf4表达,利用qRT-PCR和Western blot检测C8orf4对PEDV复制的影响;进一步,通过过表达C8orf4编码蛋白,明确C8orf4编码蛋白对PEDV复制周期各阶段的增殖变化。随着PEDV感染时间的增长,细胞中C8orf4表达呈上升趋势;过表达C8orf4显著抑制PEDV复制,而干扰C8orf4表达促进PEDV复制,并且C8orf4编码蛋白主要作用于PEDV复制周期的生物合成阶段。本研究表明C8orf4编码蛋白具有抑制PEDV复制的作用,为C8orf4的功能研究提供参考,为抗PEDV复制机制研究提供基础。

稳定表达3种猪腹泻病毒嵌合抗原的CHO细胞系构建与鉴定

为构建稳定表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪胃肠炎病毒(TGEV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)主要抗原的CHO细胞系,为猪病毒性腹泻三联疫苗的研发提供基础材料,本研究将PEDV的S基因的COE区域、TGEV和PDCoV的S基因的受体结合区域(RBD),通过同源重组的方式进行融合,克隆到慢病毒表达质粒pLV-EF1a-IRES-Puro中,包装得到重组慢病毒。使用重组慢病毒感染CHO细胞,经过嘌呤霉素和单克隆细胞筛选,基因水平和蛋白水平表达验证,成功构建了稳定表达3种猪腹泻病毒抗原融合蛋白的CHO细胞系,为进一步研制PEDV-TGEV-PDCoV的亚单位疫苗奠定了基础。

替米考星体内抑制猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒复制的效果研究

前期研究表明替米考星可在体外抑制猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的复制,为进一步了解替米考星在体内抑制PRRSV复制的效果,本研究选取健康仔猪为试验动物,使用添加替米考星的饲料和无添加的饲料分组饲养,仔猪饲喂7 d后人工感染PRRSV高致病性毒株,对比分析饲喂替米考星对猪感染PRRSV后的临床表现、体内病毒复制情况、病死率以及生长性能等方面的影响。结果显示,替米考星可显著抑制PRRSV在猪体内的复制,减轻发病症状,降低20%的病死率,并提升仔猪的日增重。相关结果可为临床使用替米考星防控PRRSV感染提供参考。

1株猪流行性腹泻病毒CH/JSNT/2022/Jan株的分离及其S基因遗传进化分析

2022年1月份江苏南通一养猪场产房仔猪发生严重腹泻,发病率和死亡率均超过80%,原因未知。死亡仔猪肠道样本经RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PoRV),结果显示:仅PEDV检测为阳性,TGEV、PDCoV和PoRV检测均为阴性。将处理好的肠内容物接种Vero细胞,接种后48 h即观察到典型细胞融合、聚集成合胞体的PEDV典型细胞病变,且能够在Vero细胞上稳定传代,表明成功分离到病毒,并将其命名为CH/JSNT/2022/Jan株。通过电镜观察,观察到近似球形、直径约为100 nm、表面有囊膜和纤突的冠状病毒样粒子,表明分离毒株可能为PEDV。进一步对该毒株的S基因进行测序,序列相似性分析结果显示,分离毒株CH/JSNT/2022/Jan与PEDV S基因参考毒株的核苷酸序列相似性为93.5%~99.7%,氨基酸序列相似性为92.8%~99.9%;遗传进化分析结果显示,该分离株为GⅡa型,与多个2020年和2021年中国流行株处于同一进化分支,与疫苗株CV777、AJ1102和LW/L的遗传进化距离较远。研究结果表明,PEDV的田间流行株在不断变化,流行株的分离对PEDV疫苗研发和新的防控策略的制定具有重要意义。

非洲绿猴FILIP1L真核表达质粒的构建及其抑制PEDV复制的研究

为探究FILIP1L(filamin A-interacting protein 1-like)蛋白对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响,以Vero细胞中提取的总RNA反转录的cDNA为模板,PCR扩增出FILIP1L基因,克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体上。过表达或沉默FILIP1L基因,通过免疫印迹和定量PCR检测FILIP1L蛋白的表达情况,并研究其抗病毒功能。结果:成功构建3×FLAG-CMV-10-FILIP1L重组质粒,转染后能够正常表达。PEDV感染Vero细胞后,FILIP1L基因的mRNA表达显著上调;过表达FILIP1L基因显著抑制PEDV的复制;下调FILIP1L的表达可显著促进PEDV的复制。综上,FILIP1L蛋白能够抑制PEDV在Vero细胞的复制,研究结果为寻找新的抗PEDV药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。

猪流行性腹泻病毒抑制干扰素λ的病毒蛋白筛选及验证

旨在验证猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株在非洲绿猴胚胎肾细胞(MARC-145)上是否具有抑制宿主Ⅲ型干扰素λ(IFN-λ)的能力,筛选并鉴定介导抑制宿主IFN-λ的病毒蛋白。通过预测猪IFN-λ1和IFN-λ3启动子序列,以提取的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)基因组DNA为模板,扩增启动子序列,构建启动子荧光素酶报告基因质粒pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc,使用双荧光素酶报告基因、实时荧光定量PCR两种方法分别检测病毒感染、病毒蛋白表达对IFN-λ1和IFN-λ3启动子活性和转录本水平的调控。结果显示:成功构建了启动子荧光素酶报告质粒pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc,证实了PEDV AH2012/12变异株在MARC-145上能够抑制宿主IFN-λ产生,且非结构蛋白(NSP)1、5、9和开放阅读框(ORF)3下调IFN-λ1,NSP1、NSP5、NSP8和ORF3下调IFN-λ3,其中NSP5的下调作用最为明显。研究结果为PEDV逃逸IFN-λ提供了理论依据,丰富了PEDV调控先天性免疫的分子机制。

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测与ORF3基因分子流行病学调查

为调查乳仔猪腹泻引起疫情的病原,本研究自2011年2月至2012年3月收集华东地区47个规模猪场共153份腹泻病料样品,采用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV),并进行ORF3基因序列分析。结果显示:26个猪场的88份样品为PEDV阳性,猪场阳性率达到55.32%,病料阳性率达到57.52%。ORF3基因测序分析显示:11个流行病毒株ORF3全基因序列大小均为675 bp,编码224个氨基酸。11个流行株ORF3基因同源性为95.9%～99.9%,编码氨基酸同源性为96.4%～100%。与欧洲代表性强毒株CV777基因同源性为96.3%～97.0%,编码氨基酸同源性为95.1%～96.4%,与CV777弱毒疫苗株基因同源性为96.8%～97.6%,编码氨基酸同源性为92.3%～93.4%,并且无疫苗病毒株ORF3基因的49个碱基缺失。与韩国病毒株比较,其基因同源性为95.0%～98.5%,编码氨基酸同源性为95.5%～99.6%。基因遗传进化树分析表明,国内外PEDV株可分为4群。我国主要流行病毒株属于第1群,与韩国病毒株亲缘关系较近,而与我国疫苗病毒株存在较大差异。该研究表明,PEDV可能是目前我国仔猪腹泻的主要病原之一,我国PEDV流行病毒株存在明显基因变异。

猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及其应用

根据Gen Bank登录的猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932 bp;最低的质粒检测浓度为10 copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的核酸进行扩增,均无PCV3目的条带出现;随机抽取扩增的16份临床病猪样品目的条带进行TA克隆后测序,结果显示均为PCV3特异性目的片段,16株PCV3江苏毒株扩增序列与已报道的PCV3/US/SD2016和PCV3/CN/Hubei-618基因序列同源性分别为98.4%~99.6%、99.0%~99.8%,而16个毒株之间的同源性为98.3%~100%。利用所建立的PCR方法检测了2014~2017年间收集的江苏省临床病猪样品938份、健康猪样品500份,PCV3的阳性检出率分别为6.93%和0.6%;其中,2014年病猪样品中的阳性率为1.92%,后呈逐渐上升的趋势,2017年达到12.67%。本研究表明,建立的PCR方法特异、敏感,可以用于临床PCV3的检测;PCV3在江苏省猪群2014年已有感染,并呈逐年升高的趋势,应予以重视。

猪流行性腹泻病毒变异株RT-PCR检测方法的建立

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引起猪呕吐、腹泻和脱水,各年龄段的猪均可发病,而哺乳仔猪发病和死亡最为严重。2010年末发生的仔猪腹泻综合征的主要病原为PEDV变异株。根据PEDV变异株S基因发生碱基缺失和插入的特征设计并合成了1对特异性引物,首次建立了PEDV变异株的RT-PCR检测方法。结果表明,所建立的PCR检测方法特异性强,不和PEDV经典毒株反应,也不与其他动物病原反应;敏感性较高,最低可检测10^(-3)ng/μL,且重复性较好。用该方法对2013—2014年我国华东地区猪场的318份临床样品进行检测,结果发现109份样品(34.3%)为PEDV变异株阳性,表明我国腹泻猪群中PEDV变异株感染较为普遍。本研究建立的PCR方法可以作为PEDV变异株在临床上的一种鉴别诊断技术。

猪传染性胃肠炎病毒分离株JS2012全基因组序列分析

设计32对PCR引物分片段扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）江苏分离株JS2012全基因组,扩增产物克隆到p MD19-T载体并测序。用DNAstar软件将JS2012全基因组序列与Gen Bank中其他13株TGEV株和猪呼吸道冠状病毒（PRCV-ISU-1）序列进行比对以及同源性分析,并绘制基因进化树。JS2012基因组序列全长28 542 bp,不包括poly A。基因组的排列为TGEV典型的基因排列序：5＇-ORF1a-ORF1b-S-3a-3b-E-M-N-7-3＇。TGEV JS2012株的ORF3基因和Miller组病毒一样有2个大片段的缺失。JS2012的S基因和Miller M6以及Virulent Purdue 2个强毒株有同样的序列特征。除Virulent Purdue外,其余Purdue株在1 123~1 128 bp处均有6 bp的缺失,JS2012与所有Miller株及Virulent Purdue一样,此处没有缺失。JS2012与其他TGEV毒株之间的碱基序列同源性为98.6%-99.9%,与Miller M6的碱基序列同源性最高,亲缘关系最近,同属于Miller组,与Purdue组相对较远。

猪捷申病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析

应用PK细胞,从临床症状上表现为腹泻的仔猪肠内容物中分离到一株病毒,对该病毒进行RT-PCR检测,证明该病毒为猪捷申病毒(PTV),命名为PTVJS2013。对该病毒进行细胞半数感染量(TCID50)测定,动物试验以及VP1蛋白基因序列测定,并与国内外16株不同血清型PTV的VP1基因序列进行了同源性比较及系统进化树分析。结果表明,猪捷申病毒JS2013 VP1基因核苷酸与8型血清型PTV同源性达到99.6%。而与其他血清型的PTV VP1基因核苷酸的同源性仅在58.3%~74.7%之间;与国内分离的PTV-Jilin/2003/2(JN710381/PTV-8)和PTV-Fuyu/2009(HQ020378/PTV-8)亲缘关系最近,同属于PTV-8血清型一个分支。

猪流行性腹泻病毒变异株XP2018的分离及S基因序列分析

本研究旨在从临床仔猪腹泻样品中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),并对其S基因进行测序分析。对腹泻仔猪小肠样品进行RT-PCR检测、病毒的分离培养、RT-PCR和间接免疫荧光鉴定、S基因测序及遗传演化分析。结果显示:仔猪腹泻由流行性腹泻病毒引起;在Vero细胞上成功分离流行性腹泻病毒,命名为XP2018,该毒株细胞病变明显,并且连续传代细胞病变稳定;该毒株S基因全长为4161 bp,与中国经典毒株CV777 S基因核苷酸同源性为92.6%,氨基酸同源性为91.0%;与近年来中国分离的其他毒株S基因核苷酸同源性为96.9%~97.6%,氨基酸同源性为96.9%~98.0%;与美国参考毒株S基因核苷酸同源性为96.9%~97.6%,氨基酸同源性为96.6%~98.3%;遗传进化分析显示XP2018毒株与与目前中国流行毒株在同一分支,与经典毒株CV777不在一个分支上。本研究成功分离1株猪流行性腹泻病毒流行毒株,为PEDV疫苗研发奠定了基础。

2017—2019年华东地区猪场主要病毒性腹泻病原调查

本研究旨在了解当前我国华东地区引起猪腹泻的主要病毒性腹泻病原的流行情况,为该地区更好地开展猪腹泻病毒的防控工作提供临床数据。分别采用RT-PCR检测方法对2017—2019年华东地区35个场别594份临床样品检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪萨佩罗病毒(porcine Sapelovirus,PSV)等5种猪的病毒性腹泻病原,并对其阳性率及混合感染情况进行统计分析。结果显示,2017—2019年的PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV及PSV的平均阳性率为分别为62.6%(372/594)、27.9%(166/594)、16.8%(100/594)、13.3%(79/594)及3.87%(23/594),二重混合感染中以PEDV+PDCoV及PEDV+PoRV为主,平均混合感染率分别为22.4%(133/594)和13.3%(79/594)。三重感染中以PEDV+PoRV+PDCoV混合感染为主,感染率为7.58%(45/594),未见四重及五重病原混合感染。2017—2019年PEDV平均阳性检出率最高,且常与PoRV及PDCoV发生混合感染,是当前华东地区猪病毒性腹泻类疫病的防控重点。TGEV和PDCoV在健康育肥猪及母猪的检出率中占比较大,表明隐性感染变得普遍,值得养殖户关注。除此之外,PSV的检出率远低于其他4种腹泻病毒。总之,随着2018年后养殖场加强生物安全防控措施和猪群管理,各病原检出率和阳性场检出率呈现逐年下降趋势。

猪萨佩罗病毒3C蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测猪萨佩罗病毒(PSV)的血清学方法,本研究以原核表达的PSV 3C重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PSV重组3C蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该ELISA方法仅对PSV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,具有良好的特异性。该方法的批内和批间重复性变异系数均小于10%,血清稀释度可以达到1∶320;采用该ELISA方法对我国2016年间采集的江苏省6个不同地区猪场的281份临床血清样品进行了检测,阳性率高达38.43%,表明江苏地区猪群中存在PSV感染。本实验建立的ELISA方法可以用于检测临床样品中的PSV抗体,特异性强、敏感性高、重复性好,是PSV流行病学调查的一种有效工具,对该病的防控具有重要意义。

华东地区猪A群轮状病毒的VP7和VP4基因序列分析

为了掌握华东地区猪轮状病毒(PRV)的流行情况,通过对华东地区猪轮状病毒流行病学的调查,分析临床猪轮状病毒对应的2个抗原序列VP7和VP4的基因型,进而丰富VP7和VP4基因库。采集2017-2018年华东地区包括江苏、浙江、上海、山东、安徽等省(市),部分猪场猪的粪便拭子共201份,PCR检测PRV阳性52份,阳性率25.9%。选择5个阳性样本进行VP7和VP4基因全长扩增并克隆测序,应用DNASTAR、MEGA5等生物学软件对其进行比对分析。结果显示:5个VP7核苷酸序列全长均为1 062 bp,5个VP4序列全长均为2 362 bp。VP7与2008年分离的G9型代表毒株NMTL的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为93.2%~95.2%和97.2%~97.5%。VP4与OSU毒株的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98.5%~98.7%和99.3%~99.4%。表明这5株猪轮状病毒的基因型鉴定为G9P7。与参考毒株相比,VP7氨基酸第100、122、180、309位有突变,但无插入和缺失现象,VP4氨基酸在第30、137、686、774位有突变,但无插入和缺失。

猪流行性腹泻病毒G2a变异株CH-HK-2021的分离鉴定及其遗传进化分析

【目的】明确猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株的遗传进化关系及变异株各亚型间的抗原性差异位点,为PEDV新型疫苗及诊断试剂盒的研发打下基础。【方法】将采集的3份PEDV阳性仔猪肠道组织样品接种至非洲绿猴肾细胞(Vero)上进行PEDV分离,分别采用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting、RT-PCR和电镜观察进行鉴定,通过TCID_(50)测定病毒滴度及绘制病毒体外增殖动态曲线;将分离毒株基因组分成33段进行RT-PCR扩增,使用Lasergene中的SeqMan拼接序列,然后以MEGA 7.0进行遗传进化分析,并以Protean中的Jameson-Wolf算法进行抗原性分析。【结果】其中1份PEDV阳性仔猪肠道组织样品在Vero细胞上盲传至第6代时出现典型的细胞病变,将其命名为CH-HK-2021毒株;IFA和Western blotting鉴定结果表明CH-HK-2021毒株能与小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体发生特异性反应,且RT-PCR能扩增获得预期的目的条带,证实分离毒株即为PEDV。CH-HK-2021毒株的直径在80~120 nm,且病毒粒子表面带有刺突样的形状,属于冠状病毒;其在Vero细胞上能稳定传代,目前已传至100代。CH-HK-2021毒株在感染Vero细胞24 h后,其病毒滴度达最高值,为10^(5.6)TCID_(50)/mL。CH-HK-2021毒株全基因组除去poly(A)尾结构为28034 bp,与PEDV参考株在全基因组水平上的核苷酸序列相似性为96.0%~98.9%,与参考毒株S基因核苷酸序列的相似性为93.1%~99.0%,其中与变异株CH/JX/01(KX058031)的核苷酸序列相似性最高,与经典毒株AVCT12(LC053455)的核苷酸序列相似性最低。CH-HK-2021毒株属于G2a变异株,为我国当前的流行毒株。G2a毒株与G2b变异株在S基因上存在42个核苷酸差异位点,在S蛋白上则存在6处抗原性差异位点,且主要的差异位点位于S2亚基上。【结论】分离获得的CH-HK-2021毒株属于PEDV G2a变异株,为我国当前的流行毒株,与PEDV经典毒株的亲缘关系相对较远。G2a毒株和G2b变异株在S2亚基上存在多处抗原性差异位点,故推测S2亚基是导致G2a毒株与G2b变异株抗原性差异的主要原因。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与常见家养动物冠状病毒的同源性分析

冠状病毒(Coronaviruses,CoVs)是一类具有囊膜的单链RNA病毒,也是目前已知的基因组最大的RNA病毒,在分类上属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)[1]。该病毒可以引起动物呼吸道、消化道和神经系统疾病,主要感染人和脊椎动物,后者主要包括猪、牛、犬、猫、鼠、禽类和一些其他动物(含野生动物)等。冠状病毒科分为4个属,即α、β、γ和δ属[2-3]。其中,α属冠状病毒感染人、长翼蝠、猪、犬、猫等[4];β属冠状病毒感染人、猪、牛、马、鼠、家蝠等,人们熟知的引起严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)的冠状病毒和引起中东呼吸综合征(Middle east respiratory syndrome,MERS)的相关病毒等[5]均属β属冠状病毒;γ属冠状病毒感染禽和白鲸2个种,其中最主要的是引起禽传染性支气管炎(Infectious brochitis,IB)[6];δ属冠状病毒感染猪、夜莺、文鸟等[7]。

猪流行性腹泻病毒JS2008株的传代培养及遗传变异分析

【目的】明确猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)JS2008株的序列特征及其连续传代后的序列变化规律,为筛选出新的疫苗候选毒株提供参考依据。【方法】将分离自华东地区某发病猪场的PEDV JS2008株在Vero细胞系上传代培养至100代,选取部分代次进行病毒滴度测定;每隔10代提取病毒RNA,采用RT-PCR对各代次病毒的S基因、ORF3基因和N基因进行扩增,并与PEDV经典和流行参考毒株进行序列比对及遗传变异分析。【结果】PEDV JS2008株经连续传代至100代,其病毒滴度由105.5TCID50/0.1 mL上升至107.5TCID50/0.1 mL。JS2008株在传代过程中共有11处碱基发生突变,其中9处发生在传代培养的第10～20代,变异主要位于S基因上(7/11);同时发现JS2008株及其传代株与attenuated DR13株的相似性最高。基于S基因和N基因序列构建的PEDV系统发育进化树均表明JS2008株各代次与attenuated DR13株同处于Group 3进化群;基于ORF3基因序列构建的PEDV系统发育进化树则显示,JS2008株各代次与attenuated DR13株均处于同一进化群(Group 2)。【结论】PEDV JS2008株通过Vero细胞系进行体外连续传代至100代,其碱基突变主要发生在病毒传代培养的第10～20代,病毒滴度明显提高,抗原量增加,为研制新型PEDV疫苗提供可能,同时推测病毒传代培养10～20代是病毒发生变异以适应细胞培养的活跃期。

2014-2016年我国江苏地区猪流行性腹泻病毒S基因的序列分析

2010年以来,猪流行性腹泻给我国养猪业造成了严重的经济损失。为分析PEDV在我国最新的遗传变异情况,本研究对2014-2016年江苏地区20株PEDV野毒株的S基因进行克隆和测序,并对其遗传进化、序列变化、抗原表位等情况进行分析。遗传进化树显示,所测的PEDV毒株可分为G1、G2两大分支,12株流行野毒株位于G2b分支上,8株属于G1群S-Indel型,而与疫苗毒株亲缘关系较远。序列对比发现,氨基酸变化主要集中于S1区N端,所测毒株JSCZ1601出现了特异性的缺失。20株毒株的核苷酸(氨基酸)同源性为95. 1%～99. 8%(94. 6%～99. 9%),与我国流行毒株AH2012、疫苗毒株Attenuated DR13、欧美毒株CV777的同源性为95. 5%～99. 3%(94. 6%～99. 0%)、93. 5%～96. 0%(92. 5%～96. 3%)、93. 6%～95. 8%(93. 0%～96. 5%)。表位分析表明,主要变异位于COE、SS2区域,两个线性表位(SS6和against2C10)相对保守;跨膜螺旋区域的预测得知毒株之间存在部分差异。这些结果表明,江苏省流行的PEDV毒株发生较明显的变异,需研发新的疫苗来控制PEDV的暴发。

猪IFN-δ5的表达纯化及其抗PEDV感染的作用分析

【目的】试验旨在建立大量表达及纯化猪δ5干扰素(pIFN-δ5)的方法,并对其抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染的作用进行分析。【方法】根据GenBank中pIFN-δ5序列(登录号:NM_001164854.1)设计引物,以猪肝脏组织cDNA为模板进行PCR扩增;将目的基因连接入经EcoRⅤ和HindⅢ双酶切的线性化pET-32a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,优化诱导表达条件,并进行SDS-PAGE和Western blotting检测;pIFN-δ5蛋白大量表达后使用镍离子亲和层析柱纯化,并测定蛋白纯度;采用细胞病变抑制法检测pIFN-δ5的干扰素效价,采用CCK8方法检测pIFN-δ5的细胞毒性,进一步测定其抗PEDV的感染能力。【结果】试验成功构建了重组表达质粒pET-pIFNδ5,经诱导条件摸索发现,在D值为0.5~0.6、IPTG浓度为0.8 mmol/L、37℃诱导条件下,目的蛋白pIFN-δ5主要表达于菌体裂解上清中;经大量表达并纯化后可获得纯度>95%的pIFN-δ5蛋白。使用VSV/MDCK细胞滴定系统检测pIFN-δ5的比活性为5×10^(4)U/mg;CCK8检测表明pIFN-δ5的细胞毒性较小。实时荧光定量PCR、Western blotting和间接免疫荧光检测结果表明,pIFN-δ5具有显著抗PEDV感染能力。【结论】本试验建立了表达和纯化pIFN-δ5的方法,通过一系列的体外抗病毒试验证实pIFN-δ5具有良好的抗PEDV感染的活性,为将pIFN-δ5作为抗病毒药物及临床应用奠定了基础。