免疫细胞化学双染技术探讨

在临床与实验病理研究中,常用到免疫细胞化学双染技术。它可在同一细胞内定性、定位、定量的显示出两种抗原成分,利于研究人员了解细胞间的形态和机能的关系,以及抗原成分间的相互关系。我们在小鼠脾脏调节性T细胞在过敏性鼻炎发病机制中的作用[1,2]和摸索体外培养胚胎大鼠背根神经节细胞作为感音神经性聋治疗的新途径[3]的实验中均使用了该技术,

基于CT的前庭蜗器断层解剖研究

目的从形态学角度阐述前庭蜗器断层解剖的微细结构,为人工耳蜗植入术和相关工作提供参考。方法采用火棉胶切片制作法,分水平位和冠状位切片并与CT断层扫描方位一致,选择代表性层面进行观察描述。水平位自下而上分蜗窗龛、蜗窗、锤骨柄、锤骨颈、锥隆起、面神经鼓室段、面神经膝、外半规管等8个层面描述;冠状位自前向后分耳蜗、前庭窗、蜗窗、面神经乳突段等4个层面描述。结果观察前庭蜗器各断层解剖的微细结构,并将火棉胶切片与CT扫描图像相对照,显示面神经迷路段终段、面神经膝和面神经鼓室段起始部与耳蜗中间周、基底周关系密切,将水平位切片与冠状位切片相结合,可全面显示面神经与耳蜗的位置关系,经比较水平位切片更具优势。冠状位切片可清晰的显示出蜗窗龛和蜗窗的解剖结构。结论通过分析研究面神经与耳蜗的位置关系以及蜗窗龛和蜗窗的解剖结构,对避免人工耳蜗植入术中对面神经的损伤和耳蜗钻孔位置定位及电极插入等都具有极大的帮助。

鼻窦筛骨成骨细胞及破骨细胞染色方法比较

为了在慢性鼻窦炎的病理研究中更清晰地展示筛骨成骨细胞及破骨细胞的形态结构,对慢性鼻窦炎筛窦骨重新塑形的组织病理学变化进行评估,用三种不同方法进行比较染色.

小鼠脾脏调节性T细胞分离纯化方法比较

在变应性鼻炎的基础研究中,探讨调节性T细胞（T regulatory cell,Treg细胞）中转录因子FoxP3对细胞因子受体Ebi3表达调控的分子机制,是以小鼠脾脏淋巴细胞为研究对象,可以通过CD荧光抗体标记,免疫磁珠分选法或流式细胞分选法获得Treg细胞。因此,建立有效的小鼠脾脏淋巴细胞分离技术是至关重要的前期工作,是进行这些研究的先决条件。本文采用了两种方法对小鼠脾脏Treg细胞进行分离,并对脾脏Treg细胞活性与获得率进行了比对分析。

喉癌标本端粒酶活性的检测

目的 :探讨端粒酶活性在喉癌发生过程中的作用。方法 :采用 TRAP方法检测 34例头颈肿瘤组织标本中的端粒酶活性。结果 :在 2 7例喉癌患者中有 2 3例检出端粒酶阳性 ,阳性率 85.2 % ,2 7例相应癌旁组织有 7例检出端粒酶阳性 ,阳性率 2 5.9% ,7例喉乳头状瘤患者中有 3例检出 ,阳性率4 2 .9%。结论 :端粒酶活化并非只发生在喉癌进展的晚期阶段 ,在肿瘤形成的早期也有一定程度的端粒酶激活。

用小牛血清作免疫组化封闭剂

在免疫病理实验中,无论是采用PAP法,ABC法,还是将二者优点结合起来的BA法,为减少非特异性背景染色,都需要封闭组织中的非特异性抗原。以往的实验中封闭血清一般采用与第二抗体相同的动物血清,如果二抗是羊抗鼠,封闭血清就必须用正常羊血清;如果二抗是猪抗兔。

上下呼吸道炎症反应相关性研究

目的 通过变应性鼻炎和变应性哮喘动物模型探讨上下呼吸道炎症反应的相关性及其机制。方法 采用卵清蛋白致敏并激发制成变应性鼻炎和变应性哮喘模型。实验动物肺功能检测仪检测肺功能、HE染色和甲苯胺蓝染色分别检测鼻黏膜和肺组织中嗜酸粒细胞和肥大细胞 ,免疫组化检测上述组织中的血管细胞黏附分子 Ⅰ (vascularcellularadhesionmolecular Ⅰ ,VCAM Ⅰ )和白细胞介素 13 (interleukin 13 ,IL 13 )的表达。以酶联免疫吸附实验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)检测外周血IL 5浓度。结果 变应性鼻炎和变应性哮喘模型鼻黏膜和肺组织中嗜酸粒细胞、肥大细胞明显多于对照组 ,变应性鼻炎组和变应性哮喘组肺功能 0 3s率显著低于对照组 ,前两组肺组织中VCAM Ⅰ和IL 13阳性血管数显著多于对照组。变应性鼻炎组和变应性哮喘组外周血IL 5浓度显著高于对照组 ,并且与嗜酸粒细胞的数量呈显著正相关。结论 上下呼吸道炎症反应具有一致性 ,变应原反复激发上呼吸道也能引起下呼吸道炎症改变和功能减退。

肿瘤坏死因子-α在分泌性中耳炎动物模型中的表达

目的检测肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)在大鼠分泌性中耳炎(otitismediawitheffusion,OME)动物模型中的表达,探讨其在OME发病机制中的作用。方法50只健康的Sprague-Dawley大鼠随机分为内毒素(endotoxin,ET)组30只及生理盐水(NS)组20只。均以右耳为实验耳,左耳作正常对照。分别经听泡注入来源于绿脓杆菌的ET35μl和等量的生理盐水。两组分别于术后6小时、1天、3天、7天及14天各处死6只、4只大鼠采集中耳渗液及血清,酶联免疫吸附法(ELISA)检测其中TNF-α水平。光镜下观察中耳黏膜各时间段的病理变化。结果组织学:ET组术后6小时出现炎症反应,3天时达高峰,14天时基本恢复正常;NS组未见明显异常改变。TNF-α检测:两组动物血清中均无表达。ET组及NS组中耳渗液中TNF-α的表达水平在术后6小时、1天、3天、7天分别为56.75±6.39、122.62±9.26,254.24±12.34、35.10±3.19,26.24±4.36、22.08±3.25,10.35±2.33、0.0pgml,14天均无表达,ET组高于NS组,有显著性意义(P<0.001)。结论TNF-α是OME发病过程中重要的致炎因子之一,其在中耳渗液中的表达水平反映OME炎症反应的过程。

声门上型喉癌cN0患者双侧颈部外科处理方式探讨

目的探讨声门上型喉癌临床颈淋巴结阴性(clinical lylymph node negative,cN0)患者双侧颈部转移淋巴结的处理方法。方法对4年间32例声门上型喉癌(尤其是位于中线者)临床cN0患者采用一侧或病变主体侧颈部Ⅱ、Ⅲ区清扫术,术中送冰冻病理检查,根据病理结果,决定对侧是否手术治疗。实施手术侧术中冰冻检查证实淋巴结转移阳性者,同时实施对侧手术;阴性者,对侧颈部随访观察。结果32例患者中11例术中冰冻检查阳性而行对侧清扫术,双侧手术的实施率为34.4%(11/32);对侧有6例术后病理证实有淋巴结转移,有效率为54.5%(6/11)。结论声门上型喉癌cN0患者Ⅱ、Ⅲ区手术可解决大部分早期病变,应用一侧或病变主体侧的诊断治疗性颈清扫手术来决定对侧手术方案,在一定程度上可达到微创和有的放矢的双重目的。

鼻内窥镜鼻窦手术几项与疗效有关因素的探讨

为探讨影响鼻内窥镜鼻窦手术疗效的有关因素，在住院手术患者中无差别延续检查以下项目：①末梢血Ｔ淋巴细胞亚群测定（１００例）；②鼻息肉免疫组化检查（１０３例）；③鼻息肉组织病理分类（１０３例）；④ＣＴ筛窦分型（１０３例）。病例中男女之比为２∶１，年龄最小７岁，最大７２岁。采用全身麻醉１０７例，局部麻醉１８９例。随访９～２２个月，临床治愈率为８５．７％，临床好转率为９９．３％。ＣＴ筛窦分型空泡型者临床治愈率高；鼻息肉组织病理学分类Ⅰ期愈合病例中纤维型优于混合型；鼻息肉免疫学分类淋巴细胞浸润无反应型临床治愈率高。对建立慢性鼻窦炎的临床分期标准、ＣＴ筛窦分型、鼻息肉的组织病理学检查及免疫学分类、术后随访与综合治疗等进行了讨论。

声带损伤后自身修复特点研究

目的通过研究兔声带固有层损伤后不同时期组织病理及主要细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)的变化情况,探讨声带损伤后的自身修复特点。方法对实验用兔声带行锐性损伤深达声韧带,于术后3 d～12个月观察声带形态学变化,HE染色、Masson染色、Alcian Blue染色及免疫组化染色,观察声带组织学结构变化及固有层内胶原、透明质酸及纤维连接蛋白等主要ECM的分布及含量变化。结果兔声带损伤后3 d～3个月成纤维细胞明显增加,40 d～12个月纤维组织持续增生,12个月声带局部无分层结构。ECM中胶原在损伤后3 d～12个月含量均明显高于正常对照组(P<0.05),在固有层内不规则紊乱分布;透明质酸在损伤后40 d内含量有增加趋势,其后降低至正常对照组水平;纤维连接蛋白在损伤后40 d～12个月时含量均高于正常对照组(P<0.05),散在分布于固有层各层。结论兔声带损伤后,在损伤早、中期各种ECM分泌增加,主要表现为以胶原为主的纤维组织明显增多且呈无序排列,透明质酸略有增加,纤维连接蛋白明显增加;在损伤后期胶原和纤维连接蛋白含量持续高于正常,声带局部瘢痕形成。

转录因子Foxp3在小鼠变应性鼻炎外周表达的实验研究

目的研究叉状头转录因子Foxp3在变应性鼻炎小鼠模型外周血单个核细胞(peripheral blood monocyte,PBMC)中的表达并与正常小鼠比较。方法选取8周雌性BALB/c小鼠30只,分为实验组和对照组,每组15只。卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏激发,建立BALB/c小鼠变应性鼻炎模型。21d后处理动物,取鼻腔固定脱钙后染色,观察其形态学特点;取脾组织研磨后红细胞裂解液分离获得PBMC,提取RNA行逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),检测Foxp3mRNA表达情况。Foxp3相对表达量采用Foxp3与内参照GAPDH灰度比值表示。结果与对照组相比,实验组鼻腔黏膜部分脱落,黏膜下可见浆液腺增生和嗜酸性粒细胞浸润。Foxp3/GAPDH灰度比,实验组Foxp3mRNA表达明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Foxp3mRNA在变应性疾病中表达下调,低于正常对照,提示Foxp3作为CD4+CD25+Treg细胞的特异性活化标志,在变应性疾病的发病机制中可能起重要调节作用。

低频感音神经性聋患者的内耳免疫学探讨

目的 测定抗内耳自身抗体,以研究低频感音神经性耳聋患者与内耳免疫的相关性。方法 通过临床详细询问病史、纯音测听、声导抗测试及ABR测试,选择低频感音神经性聋患者30例做为研究对象。以豚鼠内耳石蜡切片作为抗原,用间接免疫荧光法检测患者血清中的抗内耳抗体。结果 30例患者中有26例血清中抗内耳抗体阳性,阳性率为86.67%,P<0.01有极显著性差异;低频感音神经性聋在青少年组(≤25岁)和女性组呈高发,阳性率均为63.33％(19／30),P<0.05有显著性差异;低频感音神经性聋多为双侧耳聋,少数为单侧耳聋,双侧耳聋阳性率为86.67%(26／30),P<0.01有极显著性差异。结论 自身免疫反应参与了低频感音神经性聋的发病过程;低频感音神经聋与年龄和性别有关;低频感音神经性聋发病多为双侧聋;同时检测患者血清ⅠgM和ⅠgG内耳抗体,可协助诊断。

IL-18对大鼠分泌性中耳炎中耳NF-κB及Th2/Th1平衡的影响

目的探讨白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)对分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME)大鼠中耳微环境中核转录因子(nuclear transcription factors kappa B,NF-κB)及T辅助细胞(T helper cell,T helper cell)Th2/Th1细胞免疫平衡的影响。方法 18只SD大鼠,随机分为OME模型组(A组)、IL-18干预组(B组)和正常对照组(C组)每组各6只(12耳)。A组和B组以卵清蛋白(ovalbumin,OVA)腹腔注射致敏后以OVA耳内激发制成OME模型,C组耳内激发以磷酸盐缓冲液(phosphate Buffered Saline,PBS)替代OVA。IL-18干预组大鼠,于OVA全身致敏及耳内激发的同时,在第1、2、7、8、15、16d给予重组大鼠IL-18 1μg加生理盐水0.2ml腹腔注射,对照组和OME模型组在相同时间点腹腔注射生理盐水0.2ml替代IL-18。采用HE染色切片观察各组大鼠中耳炎症细胞的变化,免疫组化染色检测中耳黏膜和骨髓腔中IL-4、IFN-γ、NF-κB p65的表达。结果 B组中耳Th1型细胞因子IFN-γ含量较A组明显增高(P﹥0.05),Th2型细胞因子IL-4含量较A组稍有增高(P﹥0.05),A组和B组IL-4含量均明显高于C组(P﹥0.05);Th2/Th1比值A与B组比较差异无统计学意义(P﹥0.05),但A组比值明显高于C组(P﹥0.05);NF-κB p65蛋白在中耳黏膜和骨髓腔中表达三组间存在显著差异(P﹥0.05),B组NF-κB p65阳性细胞比率明显多于A组(P﹥0.05),而A组明显多于C组(P﹥0.05)。IL-18干预后OME大鼠中耳微环境中编码炎症介质基因表达的转录因子NF-κB活性明显增强,Th细胞过度活化,细胞因子过度分泌,其中IFN-γ合成显著增高,而IL-4合成也出现一定程度的增高,虽然一定程度上纠正了OME大鼠中耳微环境中的Th2/Th1免疫偏移,但是中耳变应性炎症并未得到根本缓解。结论 IL-18对Th1和Th2细胞存在双向调节作用参与OME大鼠中耳变应性炎症反应:一方面,刺激Th1细胞活化;另一方面,持续维系Th2过度反应,其机制之一可能与IL-18增强了大鼠中耳组织中NF-κB的活性有关。

难治性鼻窦炎黏膜和骨质重构的组织病理学研究

目的观察难治性鼻窦炎(refractory chronic rhinosinusitis,RCRS)黏膜和骨组织重构的组织病理学特征。方法选取20例RCRS和10例正常对照的钩突黏膜,分别行HE、Masson等染色,观察黏膜和骨组织改变。结果 RCRS患者的黏膜均存在上皮脱落、基底膜增厚、黏膜下胶原沉积;骨组织存在增生、吸收破坏等组织病理学特征,且均较对照组严重。结论鼻窦黏膜和骨质重构的组织病理学可能在RCRS发病机制中具有重要的作用。

慢性鼻-鼻窦炎患者嗅觉功能和嗅觉标记蛋白的研究

目的 探讨慢性鼻-鼻窦炎患者嗅觉功能障碍的发病机制和嗅觉标记蛋白(olfactionmarker protein,OMP)在嗅觉黏膜中的表达及意义。方法 对55例慢性鼻-鼻窦炎和11例对照组患者用T＆T嗅觉计定量检查法进行嗅觉功能主观检测,并应用免疫组化技术检测其嗅黏膜嗅觉标记蛋白的表达和分布。结果 慢性鼻-鼻窦炎患者主诉有嗅觉障碍者为50.9％(28/55),经主观嗅觉功能检测嗅觉障碍者为85.5％(47/55);对照组患者主诉有嗅觉障碍者为9.09％(1/11),经主观嗅觉功能检测嗅觉障碍者为18.2％(2/11),差异有显著性(x2=9.86,P<0.01)。对两组嗅黏膜进行OMP免疫组化染色显示:OMP存在于嗅黏膜的嗅细胞和微绒毛细胞中,OMP染色细胞数随嗅觉障碍程度加重而逐渐减少或消失。结论 慢性鼻-鼻窦炎患者嗅觉障碍的主要原因是嗅黏膜中嗅细胞的减少、萎缩和退化所导致的对嗅素的不能察觉和认识。