表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

为构建表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒(SVA),本研究在感染性cDNA克隆p SVA-I212V/S460L的基础上,采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag II并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端,构建感染性cDNA克隆,命名为p SVA-Strep,并采用双酶切和测序鉴定正确后,将p SVA-Strep转染BHK-21细胞拯救重组病毒,收集病变细胞上清,并将含有病毒的细胞上清和野生型SVA(SVA-WT)分别感染BHK-21细胞,以未感染病毒的BHK-21细胞作为阴性对照,感染后24 h分别以鼠源SVA VP2蛋白单克隆抗体(MAb)5D10(1∶1000)、鼠源Strep-tag II MAb(1∶2000)作为一抗,以FITC标记的山羊抗小鼠Ig G(1∶2000)为二抗,采用间接免疫荧光试验(IFA)对重组病毒鉴定。IFA结果显示,以鼠源SVA VP2蛋白MAb 5D10为一抗,SVA-WT和重组病毒感染的细胞均出现绿色荧光,以Strep-tag II MAb作为一抗时,仅有重组病毒感染的细胞出现绿色荧光,经SVA-WT感染的BHK-21细胞及阴性对照细胞均无绿色荧光,表明拯救了Strep-tag II标记的重组病毒,并将其命名为r SVA-Strep。将r SVA-Strep在BHK-21细胞中连续传10代,每隔2代采用引物VP1-F/R经PCR鉴定并对第10代重组病毒的VP1基因测序以鉴定r SVA-Strep的遗传稳定性。结果显示,每隔两代的重组病毒经PCR扩增后均出现约780 bp的目的条带,第10代重组病毒扩增的VP1基因测序结果显示Strep-tag II基因仍在重组病毒中,且无基因突变,表明r SVA-Strep的遗传稳定性较强;将SVA-WT和r SVA-Strep分别以MOI 0.01感染BHK-21细胞,在感染后4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h收获病毒测定病毒滴度并绘制生长曲线,结果显示在病毒感染36 h内r SVA-Strep和SVA-WT生长动力学基本一致,表明Strep-tag II的引入在病毒感染36 h内对SVA的复制基本无影响。采用0.2%甲醛充分灭活r SVA-Strep,并利用Strep-TactinRXT Purification纯化试剂盒纯化该灭活病毒,将r SVA-Strep灭活病毒上清加至Strep-Tactin亲和层析柱,分别用不同体积洗脱缓冲液依次洗脱病毒并通过western blot鉴定病毒的纯化效果。对纯化过程中不同洗脱液洗脱病毒的western blot结果显示,不同体积的洗脱液中E1、E2和E3均出现VP0和VP2两条带,且E1和E2的条带最明显,表明洗脱缓冲液的最佳洗脱体积约为2.2 CV;以上结果表明r SVA-Strep可通过Strep-Tactin亲和层析柱一步法纯化。本研究在SVA中插入Strep-tag II标签,为SVA灭活疫苗的快速纯化提供技术手段,也为其他病原的快速纯化方法的建立提供参考。

蒸发压力和冷凝温度对船用柴油机余热回收有机朗肯循环系统性能的影响

以柴油机废气余热作为研究对象,利用MATLAB软件建立有机朗肯循环余热回收系统热力学模型,对比6种工质的物性参数,选择苯为工质,仿真研究系统净输出功率、热效率、功耗因子和[火用]效率等热力学性能参数随蒸发压力以及冷凝温度的变化规律。仿真结果表明:蒸发压力增大,净输出功率和[火用]效率先增大后减小,热效率和功耗因子增大;蒸发压力为0.6 MPa时净输出功率最大,为4358 k W;蒸发压力为1.6 MPa时[火用]效率最大,为54.5%;冷凝温度升高,系统净输出功率、热效率和[火用]效率减小,功耗因子增大。

延安《解放日报》三篇重要社论的历史贡献与深远意义研究

20世纪40年代,延安《解放日报》报社曾发表《致读者》《党与党报》《本报创刊一千期》三篇重要社论。这三篇重要社论是指导《解放日报》成功改版的纲领性文件,开创并奠定了当代报纸版面的基本形态,是中国共产党党报理论和新闻党性原则得以形成、确立和阐发的经典文献。文章通过剖析《解放日报》三篇重要社论的基本情况与主要特征,发现这三篇重要社论虽主要由报社负责人执笔,但代表的不仅仅是报社的观点,其中还融入了毛泽东的不少见解与思想,一定程度上代表了党中央的意志。因此,应加强对这三篇重要社论的研究,肯定《解放日报》三篇重要社论对党的新闻事业的历史贡献,深刻领会其深远意义。

基于DES算法的测发控系统无线通讯加密方案

针对无线通讯应用于导弹地面测发控系统时,可能造成信息泄露等问题,提出了一种基于DES算法的加密方案.该方案在明文数据中加入可变的冗余码,保证了加密可靠性;在加密后的密文数据包之间嵌入随机标识码,使得通讯数据的结构有效隐藏,并为接收端恢复数据提供支持.分析可知,该方案易于实现,保密性好,适合应用于导弹测发控系统中.

羊口疮病毒强毒株与传90代毒株毒力相关基因的序列比较

为比较羊口疮病毒(ORFV)强弱毒株毒力相关基因序列,将分离自山东省某发病羊场的强毒株ORFV/QD/2015,在山羊皮肤成纤维细胞上连续传90代,然后将ORFV/QD/2015强毒株和传90代后毒株的质粒测序结果与已经公布的9组ORFV全基因序列中的ORF020、ORF112、ORF117、ORF127基因进行比对。结果显示:ORFV/QD/2015强毒株与公布毒株毒力相关基因的同源性高,而传90代毒株与其同源性有所降低。将强毒株与传90代毒株4组毒力相关基因的核苷酸进行比对,发现其基因编码氨基酸均发生了多处变异,其中ORF020发生了7处,ORF112发生了52处,ORF117发生了14处,ORF127发生了15处。比对后发现,核苷酸与编码氨基酸变异最多的为ORF112基因,最少的为ORF020基因。两毒株间的抗原指数也有明显变异。研究认为,ORFV毒力相关基因的变异可能与其毒力有很大联系,这个变化可能与传代过程中基因发生多处变异有关,也可能是这些毒力基因共同作用的结果。

Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定

为了解内蒙古呼和浩特部分地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况,本研究采用RTPCR技术从采集自内蒙古某屠宰场的32份牛肺脏样品中检测出两株BVDV,命名为BVDV-HT1704、BVDV-HT1723株。通过在MDBK细胞上传代、免疫荧光试验、5’-UTR基因序列测定及分子进化分析对检测出BVDV阳性的肺脏组织进行鉴定。结果显示:在MDBK细胞中盲传10代后没有病变产生;经IFA检测,在病毒感染的细胞浆内产生特异性荧光;序列同源性和系统进化分析表明该毒株属于BVDV-Ⅱa型,且两株分离株属于单一的分支。本研究首次在我国正常牛肺脏组织中分离到BVDV,为了解BVDV在内蒙古自治区的流行情况及地理分布提供依据,并为相关疫苗的研发奠定了基础。

羊口疮病毒B2L基因密码子优化及截短表达

B2L蛋白是羊口疮病毒(ORFV)的结构蛋白,也是病毒的保护性抗原,可以刺激机体产生强烈的抗病毒反应。为表达出高可溶性的B2L蛋白并检测其免疫原性,将羊口疮病毒B2L基因进行密码子偏爱性优化设计,并截取抗原性高、疏水性好的区域,构建了His-tag融合可溶性标签的表达重组载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,经IPTG诱导,利用SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的His融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA agarose亲和纯化后,进行Western-blot验证。结果显示,经过SDS-PAGE和Western-blot鉴定的目的条带分子质量与预期大小相符。本试验成功在上清中表达和纯化出B2L基因编码蛋白。

构建新时代劳动教育协同育人格局

劳动教育作为中国特色社会主义教育制度的重要内容,直接决定了社会主义建设者和接班人的精神面貌、价值取向和技能水平。《关于全面加强新时代大中小学劳动教育的意见》对加强劳动教育进行了全面的部署和安排,在实践过程中如何有效落地是摆在各级各类学校和广大教育工作者面前亟待解决的问题。

牛病毒性腹泻病毒E2基因生物信息学分析及可溶性表达

为了获得牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2基因的最佳可溶性蛋白,本试验根据GenBank已公布的BVDV E2基因序列,利用DNAStar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后合成并连接到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-Opti-E2;转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,经SDS-PAGE和Western blot分析,成功获得大小为43 kDa的BVDV E2基因的最佳可溶性蛋白,且该蛋白特异性较好。本试验E2蛋白的成功表达可为后续ELISA方法的建立和亚单位疫苗的开发奠定基础。

政社互动:多元共治的磁器口历史街区环境治理体系构建

磁器口古镇旅游发展在重庆旅游业的发展中占有重要地位,2018年国庆七天假日,磁器口古镇接待62.69万人次,同比增长31.4%,日均游客接待量8.9万人。磁器口历史文化街区是主城片区网红景区,那到底是昙花一现,还是可持续发展呢?

磁器口环境保护多元共治机制探究

始建于北宋时期的磁器口,是全国首批中国历史文化街区之一,也是我市确定的28个传统风貌片区之一.“一条石板路,千年磁器口”是重庆古城的缩影和象征,被赞誉为“小重庆”.数据显示,2017年磁器口古镇游客接待量达1086.14万人次.而2018年以来,磁器口的人气更旺了.今年端午节三天假期共接待游客19.36万人次,日均游客接待量达6万余人。

磁器口古镇环境保护的多元共治模式探究

国家级历史文化街区——磁器口古镇,是重庆历史文化名城保护体系的重要空间载体,也是重庆建设国际知名旅游目的地的重要旅游品牌。目前,磁器口古镇环境治理已基本形成"以保护兴旅游、以旅游促保护"的互促良性发展格局。随着经济新常态以及经济社会与文化消费结构的转型升级,磁器口古镇也面临着新的发展问题,单纯靠某一方的管理和保护进行环境治理,已无法满足可持续发展需要,必须从单一的行政管制模式向多元共治转变。多元共治应形成以政府为指导、以企业为辅助、以社区居民为基础、以社区组织为纽带、以环保非政府组织为补充的"政社互动"环境治理架构,以此实现磁器口古镇更好更快保护和可持续发展。

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其应用

为制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)单克隆抗体(MAb)及其直接荧光标记抗体,本试验用纯化的牛病毒性腹泻病毒Ht01株免疫雌性BALB/c小鼠。间接ELISA测其血清效价,取抗体效价达标小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合。用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行2次亚克隆后注射入小鼠腹腔制备单抗腹水。利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水,用间接免疫荧光试验测定其活性,用SDS-PAGE试验测定其纯度。经活性、纯度检测合格后,采用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联;用葡聚糖G-25 Medium介质进行分离纯化。结果,本研究共获得2株能够稳定分泌IgG1类型的阳性杂交瘤细胞株和一种直接荧光抗体,分别被命名为BMAb11、BMAb20、DB11。稳定性试验表明,杂交瘤细胞分泌的抗体稳定性好。ELISA、间接免疫荧光试验和直接免疫荧光试验表明,单克隆抗体和直标荧光抗体均与BVDV发生特异性反应,说明它们的特异性较好。经ELISA鉴定,腹水抗体效价达到1∶12 800。直接荧光抗体荧光素与蛋白的摩尔比(F/P)为3.34,标准值在2.0～4.0之间,符合标准。上述研究结果表明,本研究制备的单克隆抗体和直标荧光抗体可用于BVDV的检测,为BVDV的临床诊断奠定了基础。

举手之劳

阳光透过轻飘着的窗帘抚照在本上,那浓浓的墨迹散发着幽香,格外温馨,那举手之劳是友谊的见证。教室里寂静无声,屏息静听,只有笔尖不时在纸上的"沙沙"声,像蚕在贪婪地咀嚼着桑叶。抬头望,同学们正在聚精会神地翻看笔记,临近考试,大家都在争分夺秒地汲取知识.