狐源犬瘟热病毒的分离鉴定及H基因遗传变异分析

为分离鉴定以及分析我国毛皮动物中流行的犬瘟热病毒(CDV),本研究采用Vero-SLAM细胞从山东省荣成市某养殖场疑似CDV感染狐狸的肺脏样品中分离到1株病毒,经RT-PCR、病毒形态观察、间接免疫荧光试验、动物回归试验等鉴定,确认该分离株为CDV野毒株,命名为SD(14)7。对其H基因进行克隆和测序分析,结果表明,SD(14)7与其他Asia-1型野毒株H基因的相似性为97.1%~99.6%,其中与SD(12)1和SD(13)5的相似性最高,分别为99.5%和99.6%,与CDV强毒株He Bei株的相似性为97.8%,与疫苗株CDV3、Onderstepoort、Snyder Hill以及ConvacH基因的相似性为90.4%~90.9%。H基因系统发育树分析表明,SD(14)7株属于Asia-1型,为我国当前流行的野毒株。氨基酸序列分析显示,SD(14)7株H蛋白发生了I542N和Y549H突变,在aa542~aa544位增加了1个潜在的N-糖基化位点,潜在的N-糖基化位点数增加至10个。本研究为CDV毒力变化和宿主嗜性的研究提供了参考依据。

水貂IFN-α、IFN-β及IFN-γmRNA荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为采用SYBR GreenⅠ染料建立检测水貂IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中登录的MiIFN-α和MiIFN-β、MiIFN-γ和3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因序列,分别设计合成特异性引物,通过RT-PCR扩增MiIFN-α、MiIFN-β、MiIFN-γ和MiGAPDH的基因片段,构建到pMD18-T载体中制备质粒标准品,建立了相应基因mRNA的荧光定量RT-PCR检测方法并建立标准曲线。结果表明,MiGAPDH、MiIFN-α和MiIFN-β和MiIFN-γ基因的Ct值与标准品稀释度在10拷贝质粒/μL^107拷贝质粒/μL内均呈良好的线性关系,相关系数(R2)均为1.00,熔解曲线均呈单一熔解峰,检测下限为10拷贝质粒/μL,重复性试验表明组内、组间变异系数均小于4.5%。临床样品检测结果表明水貂感染肠炎病毒后,MiIFN-α、MiIFN-β和MiIFNγ相对表达水平均在6d达到最高峰值,MiIFN-α相对表达量要比MiIFN-β和MiIFN-γ相对表达量高两个数量级,并且在感染期(4d^6d)MiIFN-α相对表达量明显提高。本研究为水貂IFN mRNA的定量分析提供了有效工具。

水貂病毒性肠炎研究进展

水貂病毒性肠炎是一种由水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)引起的急性、高度接触性传染病,是威胁水貂养殖业的主要病毒性疾病之一,给我国乃至世界各国水貂养殖业造成巨大危害。本文从MEV的生物学特性、临床特征及病理变化、实验室诊断方法和疫苗研究进展等角度对水貂病毒性肠炎的研究进展进行概述。

水貂白细胞介素-4基因的克隆、序列分析与原核表达

为了获得高纯度的白细胞介素-4(IL-4)蛋白,对分离得到的水貂外周血淋巴细胞经植物血凝素(PHA)诱导后,提取淋巴细胞总RNA,根据GenBank中登录的雪貂IL-4基因序列,设计并合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得了水貂IL-4基因序列全长399bp,编码132个氨基酸,与雪貂氨基酸序列同源性高达99.2%,与熊猫、犬同源性均为90.0%。将编码成熟蛋白基因构建到原核表达载体pProEX-HTb,IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting结果显示,IL-4表达产物为15ku的包涵体蛋白。通过His-Trap HP亲和层析预装柱变性、复性洗脱可获得高纯度的重组IL-4蛋白。本试验为水貂IL-4基因的进一步研究奠定了基础。

貂源伪狂犬病毒DL14/08株免疫原性及其保护效果的研究

为研制貂源伪狂犬病(PR)灭活疫苗,本实验室从疑似患PR的水貂脑组织中分离到一株PR病毒(PRV)DL14/08株(10^(7.10)TCID_(50)/m L),采用甲醛灭活以铝胶为佐剂制备了水貂源PR灭活疫苗。采用水貂和家兔对疫苗进行安全性检验和最小免疫剂量测定,结果显示水貂和家兔的最小免疫剂量均为5×10^(5.6)TCID_(50)/m L;采用研制的PR灭活疫苗和商品化猪用PR灭活疫苗免疫水貂,免疫21 d后平均中和抗体分别为1∶516和1∶348,用相当于100倍半数致死量毒力的分离株病毒攻毒,自制灭活疫苗组保护率为100%,商品化疫苗组保护率为80%。实验结果表明,制备的水貂源PR灭活疫苗抗体水平及攻毒后保护率明显高于商品化疫苗,能够有效保护强毒株对水貂的攻击,可以作为水貂伪PRV预防和控制的候选疫苗株。

水貂白细胞介素-6基因的克隆与序列分析

根据Gen Bank中登录的几种动物白细胞介素-6(IL-6)基因序列,设计特异性引物,将水貂外周血淋巴细胞经植物血凝素(PHA)诱导、TRIzol法裂解后提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行扩增,连接p MD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,获得阳性重组质粒。核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长为633bp,编码210个氨基酸,与已知驯养雪貂IL-6序列的同源性最高,为98.4%,氨基酸同源性为96.7%。水貂IL-6基因的成功克隆为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

45CrNiMoV钢过冷奥氏体组织转变研究

本文利用磁性法、膨胀法、金相法按照国家标准GB5057-85、GB5058-85技术条件测定45CrNiMoV钢的过冷奥氏体等温转变曲线(TIT图)及连续冷却转变曲线(CCT图)。结果表明:在ITT图中有珠光体、贝氏体和马氏体转变,有两个"鼻尖"。在CCT图中,存在珠光体、贝氏体和马氏体转变。该钢的Ms点为290℃。

水貂阿留申病病毒NS1蛋白B细胞抗原表位的分析与鉴定

为了鉴定水貂阿留申病病毒（AMDV）NS1蛋白的抗原表位,利用生物信息学软件对NS1蛋白的理化性质、二级结构、三级结构及抗原性进行综合分析,预测结果显示,35~56aa、134~143aa、273~288aa、302~321aa、387~395aa、499~509aa存在抗原表位的可能性较大。采用固相合成法合成6条候选表位肽,将其作为包被抗原,利用水貂阿留申病病毒阴性血清及阳性血清,采用间接ELISA检测方法验证候选表位肽的反应原性,结果显示合成的6条候选表位肽的反应原性均较好,其中302~321aa对AMDV抗体识别的特异性较高,与对流免疫电泳技术（CIEP）检测方法的符合率可达86.7%,并能够检测出部分CIEP检测呈阴性而PCR检测呈阳性的感染早期血样。本研究为水貂阿留申病病毒多肽检测抗原开发及诊断方法的建立奠定了基础。