溶藻弧菌去乙酰化酶基因cobB克隆及其功能验证

旨在研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)去乙酰化酶cobB基因的功能。进行了cobB基因的克隆,生物信息学分析,CobB蛋白质诱导表达、纯化及功能研究。CobB蛋白质的相对分子质量为27.09750 kD,理论等电点为5.15,化学式为C_(1186)H_(1865)N_(339)O_(369)S_(10),亲水性平均系数(GRAVY):-0.409,为亲水蛋白。CobB与同弧菌属的魔鬼弧菌(Vibrio diabolicus),哈维弧菌(Vibrio harveyi),霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有高度同源性,在革兰氏阴性菌中相对保守;融合蛋白大小约为53 kD,去除标签后CobB蛋白分子量约为27 kD;CobB蛋白最适表达条件为37℃,0.4 mmol /L IPTG下诱导4 h。功能分析表明,CobB对乙酰化蛋白具有去乙酰化作用。

溶藻弧菌gr基因缺失株构建及其生物学特性

【目的】研究敲除谷胱甘肽还原酶(GR)基因gr对溶藻弧菌HY9901生物学特性的影响。【方法】通过同源重组技术和Overlap PCR等分子生物学手段构建溶藻弧菌HY9901的gr基因缺失株,通过反转录验证并检测其遗传稳定性,绘制该菌的野生株和缺失株的生长曲线,测定该菌野生株和缺失株的生物膜形成能力、抗生素敏感性、胞外蛋白酶活性和泳动能力等生物学特性。【结果】gr基因的缺失几乎不影响溶藻弧菌的生长趋势,但敲除gr基因后溶藻弧菌对呋喃唑酮、头孢唑林、四环素等敏感性增强,该菌的生物膜形成能力增强显著提高。缺失株△gr的胞外蛋白酶活性和泳动能力均低于野生株。【结论】谷胱甘肽还原酶在溶藻弧菌的毒力、生物膜形成、药物敏感性、泳动等方面有重要作用。

不同扩散性的两种碳源对生物除磷污泥颗粒化早期聚集特性的影响

平行运行2组构型相同的低高径比SBR反应器,分别以高扩散性的NaAc(1^(#)反应器)和低扩散性的可溶性淀粉(2^(#)反应器)为单一碳源模拟生活污水,研究不同扩散性的两种碳源对生物除磷污泥颗粒化早期聚集特性的影响。结果表明:在培养初期可溶性淀粉(2^(#)反应器)通过絮凝作用最先在系统中形成粒径较大但疏松的絮体污泥,在培养后期NaAc(1^(#)反应器)能够显著加快污泥的聚集和颗粒化速度。反应器运行90d后,1^(#)系统初步实现了颗粒化,污泥粒径在200μm左右,颗粒污泥轮廓清晰,结构密实;2^(#)系统污泥以絮体为主,粒径为50μm左右。两个系统中COD去除率均达90%以上,2^(#)反应器除磷率低于1^(#)反应器。1^(#)系统内Defluviicoccus(88%)占据绝对优势,除磷由Dechloromonas(5.46%)完成;2^(#)系统优势菌属为Ornithinibacter(33.19%)和反硝化聚磷菌Tessaracoccus(38.34%)。

溶藻弧菌磷酸甲基嘧啶合酶(ThiC)的原核表达及其乙酰化修饰鉴定

为研究溶藻弧菌Vibrio alginolyticus磷酸甲基嘧啶合酶(phosphomethylpyrimidine synthase,ThiC)是否存在乙酰化修饰,以溶藻弧菌HY9901基因组为模板,PCR扩增ThiC基因,构建pET-28a-ThiC原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,并优化其表达条件,然后用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达及乙酰化情况。结果表明:克隆获得的溶藻弧菌ThiC基因长度为1941 bp;重组蛋白成功在大肠杆菌BL21中表达,相对分子质量为72500,其最佳诱导条件为IPTG 0.1 mmol/L、温度37℃、诱导时间3 h;经Western blot检测显示,ThiC蛋白具有乙酰化修饰,但在体外不能通过乙酰化酶途径去乙酰化。研究表明,溶藻弧菌ThiC原核表达载体构建成功,该蛋白存在乙酰化修饰,但体外不能去乙酰化,本研究结果为溶藻弧菌的维生素合成过程中酶的翻译后调控机制研究提供了科学参考。

溶藻弧菌AphB蛋白的原核表达及其乙酰化验证

【目的】研究LysR家族转录因子AphB蛋白是否存在乙酰化修饰,为进一步研究乙酰化修饰对该蛋白功能的影响提供理论基础。【方法】以溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901 LysR家族转录因子AphB为对象,根据GenBank上溶藻弧菌aphB序列(No.WP_005380599.1)设计引物,采用大肠杆菌表达体系异源诱导表达,设置时间、温度和IPTG浓度梯度优化表达条件,最后纯化AphB蛋白,通过抗乙酰赖氨酸特异性抗体验证AphB蛋白的乙酰化修饰程度。【结果】aphB全长约876 bp,37℃时菌液加入0.1 mmol·L^(-1)的IPTG诱导6 h后,AphB蛋白的表达量最高,纯化后的蛋白大小为37.3 kD,AphB自身存在乙酰化修饰位点,但其乙酰化程度在体外不受脱乙酰酶CobB的调控。【结论】初步证明了AphB蛋白是一种乙酰化蛋白且在体外不能被脱乙酰酶CobB脱乙酰化,研究结论丰富了原核生物弧菌中乙酰化修饰的相关理论,为溶藻弧菌毒力基因aphB的翻译后调控机制研究提供了科学参考。

溶藻弧菌PepA蛋白原核表达载体的构建及其乙酰化鉴定

旨为构建溶藻弧菌HY9901 PepA蛋白的原核表达载体、优化其表达条件,并分析该蛋白是否存在乙酰化调控。首先设计特异性引物经PCR克隆pepA基因,构建表达载体pET-28a-PepA并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),然后用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达及乙酰化情况。结果显示,表达菌株可以正确表达重组蛋白(60.7 kD),其最佳表达条件为:体积分数为0.1%的IPTG,37℃诱导5 h;Western blot结果表明,PepA蛋白是乙酰化蛋白,且在体外不存在去乙酰化。

大分子有机物作用下反应器构型对生物除磷污泥颗粒化的影响

以大分子有机物为碳源,考察短时顶部进水+厌氧搅拌(R1)与长时底部推流进水+厌氧静置(R2)两种序批式反应器对生物除磷污泥颗粒化的影响。结果表明:R1反应器污泥一直维持絮体状态且易发生丝状膨胀,SVI30在88.85~1212.12 mL·g^(-1)之间波动;R2反应器污泥可在110 d实现颗粒化,成熟颗粒污泥结构密实,SVI30为38.39~58.92 mg·L^(-1)。R2反应器在厌氧段挥发性脂肪酸产量更高,更有利于聚磷菌的生长。R2反应器污泥胞外聚合物(EPS)中蛋白质和多糖含量均高于R1,分别为26.24 mg·gVSS^(-1)和7.15 mg·gVSS^(-1),可与更多Ca、Mg结合促进污泥颗粒化。16S rRNA基因高通量测序显示,R2反应器有利于水解发酵菌群norank_f_Chitinophagaceae(27.71%)、norank_f_Saprospiraceae(4.86%)和分泌EPS菌群Flavobacterium(9.38%)的生长,促进了聚磷菌的生长和污泥的颗粒化。