缺氧诱导因子-1α对SD大鼠心室肌细胞缺血再灌注损伤的短暂保护作用

目的探讨缺氧诱导因子(HIF)-1α在SD大鼠心室肌细胞在缺血再灌注损伤(IRI)过程中的作用。方法原代培养心室肌细胞,继而用脂质体转染pc DNA3.1-full length HIF-1α和空载至心室肌细胞;建立体外心肌细胞IRI模型;分成处理后培养6 h和5 d两个检测体系;MTT法检测细胞活性,Western印迹和免疫细胞化学法检测相关蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果心室肌细胞缺血再灌注(IR)后细胞活性下降,凋亡率上调。在转染pc DNA3.1-full length HIF-1α质粒后,细胞活性明显增加,bcl-2和血管内皮生长因子(VEGF)表达上调,凋亡受到抑制;转染pc DNA3.1-full length HIF-1α组培养5 d后虽然HIF-1α仍高表达,但VEGF和bcl-2表达量下降,细胞活性下降,凋亡率升高。结论大鼠心室肌细胞IR后活性下降,凋亡增加;短时间内HIF-1α可在一定程度上保护细胞,增强细胞活性,抑制凋亡;但长期作用后,HIF-1α对IRI的心肌细胞并未起到保护作用。

蚯蚓纤溶酶活性研究

蚯蚓是优质的蛋白质饲料,但蚯蚓体内含有纤溶酶等生物活性物质,大量使用会造成动物机体的损害。为了保证蚯蚓作为蛋白饲料在畜牧业生产中的应用安全,本研究采用琼脂糖-牛血纤维蛋白原平板测定了蚯蚓水解液在不同时间、不同pH值和不同温度下的纤溶酶活性。结果表明,随着pH值降低和温度的升高蚯蚓纤溶酶的活性逐渐降低,但直至pH值为1时或温度达到100℃时纤溶酶仍具有较强的活性。因此认为,蚯蚓纤溶酶在胃液的酸性条件下或通常的环境温度下难以完全灭活,把蚯蚓作为蛋白饲料或饲料添加剂使用时应严格控制动物的摄入量,以保证养殖业的安全生产。

RNA干扰抑制cyclin E表达对食道癌细胞Eca-109增殖的影响

目的探讨利用RNAi技术抑制cyclin E的表达,研究cyclin E在食道癌细胞Eca-109生长、增殖过程中的作用。方法设计针对cyclin E基因的siRNA序列,合成并克隆入pGFU6/neo质粒中,用脂质体转染法将重组质粒转染Eca-109细胞。采用RT-PCR和免疫印迹试验检测稳定转染的Eca-109细胞中cyclin E的表达水平。台盼蓝排斥法、MTT法、3H-TdR掺入试验、平板克隆形成试验检测干扰cyclin E后对细胞活力以及增殖能力的影响,流式细胞仪测定细胞周期时相分布。Western印迹检测细胞增殖有关蛋白PCNA、p21、bax和bcl-2表达变化。结果台盼蓝排斥法、MTT法、3H-TdR掺入试验和平板克隆形成试验显示转染组细胞活力及增殖受到抑制;阻滞在G0/G1期细胞比例增加。Western印迹表明PCNA和bcl-2蛋白表达量下降;而p21蛋白和Bax蛋白表达量上升。结论沉默cyclin E基因能明显抑制食道癌细胞Eca-109的活力及增殖能力,并且细胞周期被阻滞,机制可能与下调肿瘤细胞内PCNA以及上调p21的表达有关。

TumorFisher CTC检测技术用于晚期肝细胞癌抗PD-1/PD-L1治疗决策和疗效评价一例报告及文献复习

肝细胞癌(HCC)的发病率和病死率正在逐年增长,严重威胁人类的健康和生命。近年来,以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫治疗迅速发展,但对晚期HCC疗效有限。治疗中实时监测循环肿瘤细胞(CTC)PD-L1表达,是评估免疫治疗有效性的重要指标之一。本案例通过TumorFisher检测技术实时监测1例HCC患者免疫治疗前后总CTC数及PD-L1+CTC个数,结合影像学和血清学检查结果进一步评估患者免疫治疗疗效。患者治疗前总CTC数为5个/2 mL,PD-L1+CTC为5个/2 mL,PD-L1+CTC/总CTC为100%。用PD-1/PD-L1抑制剂行3周期免疫治疗后,PD-L1+CTC/总CTC逐渐降低,肿瘤缩小,血清AFP及PIVKA-Ⅱ逐渐下降,PD-L1+CTC/总CTC变化与肿瘤标志物、MRI检查结果一致。PD-L1+CTC/总CTC可作为HCC免疫治疗疗效评估的辅助指标。

MORF4基因诱导HeLa细胞衰老

目的建立MORF4基因高表达诱导HeLa细胞衰老模型,探索MORF4基因对HeLa细胞衰老的影响。方法分别将pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4和pcDNA3.1(+)空载质粒转染人宫颈癌HeLa细胞株。SA-β-Gal染色检测细胞衰老,MTT法及流式细胞术检测细胞周期变化及细胞的增殖活力,两者共同确定MG-132处理的最适条件。Western印迹检测MORF4、PCNA基因的表达。结果质粒经酶切和测序鉴定,证明pcD-NA3.1(+)/Flag-MORF4质粒中含有目的基因序列;经浓度梯度1.25、2.5、5、10μmol/L MG-132处理转染细胞2、4、24、48 h后,SA-β-Gal染色和MTT检测结果显示10μmol/L MG-132处理24 h的转染细胞明显衰老,细胞活力降低;细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞明显减少,增殖受到抑制;Western印迹检测结果显示MORF4蛋白在细胞中的含量明显升高,而与增殖相关基因PCNA表达下调。结论构建的pcDNA3.1(+)/Flag-MORF4质粒在HeLa细胞中表达;并在MG-132作用下,使MORF4基因的表达产物积累,从而影响PCNA蛋白的表达量,抑制HeLa细胞的增殖活性,阻滞细胞周期的进行,导致细胞进入衰老状态。

适用于空间环境的蛋白质分析芯片检测装置研究

为实现空间环境下蛋白质检测,设计开发了一套小型化、集成化、高灵敏度的微流控芯片蛋白质检测装置,包括小型化光学检测单元、自动进样单元、自动控制单元等。该装置基于Elisa和Western blotting相结合的蛋白检测技术完成小型化光信号检测装置的研制。装置完成后对EGFR、FGFR4、HER2、IL6等四种蛋白质进行验证检测,结果显示各个样品回归分析R2值均能够达到0.98以上;对多个蛋白进行联合检测证实本装置专一性很好,不会引起非特异性反应,证实了检测装置的有效性。

利用硅胶作为固载的Elisa方法开发及应用

基于微流控原理设计了一种蛋白检测方法，采用Elisa和Western blot相结合的方法，将捕获抗体固载至微流控芯片的硅胶膜上，然后采用双抗体夹心法进行免疫反应，最后采用Western blot的化学发光法进行检测。对HER2、EGFR、FGFR4、IL6等蛋白质进行检测，结果发现，FGFR4，HER-2，EGFR，IL6各个样品线性回归均能够达到0．99以上；对多个蛋白进行联合检测，结果显示本方法转移性很好，不会引起非特异性反应，说明该方法在多样品多蛋白检测方面有了很大优势。

食道癌细胞在异鼠李素处理中应激作用的研究

在前期研究的基础上,探究异鼠李素抑制食道癌细胞增殖作用过程中出现的细胞应激反应的分子机制.将食道癌Eca-109细胞经异鼠李素处理后,在前72h细胞出现持续增殖.前期细胞核内NF-κB/p65和NF-κB/p50的表达上升而后期逐渐降低;bcl-2、COX-2、mcl-1基因的表达在前期上调,后期下调;IκBα和bax的表达先下降而后上升;加入MG-132后NF-κB/p50和NF-κB/p65的核内表达明显降低,Eca-109细胞增殖受到抑制,在前72h细胞未出现持续快速增殖现象.表明在异鼠李素处理前期,通过食道癌细胞应激作用激活NF-κB信号途径,导致下游相关基因的表达变化从而抑制异鼠李素诱导Eca-109细胞的凋亡作用,而在处理后期异鼠李素诱导的细胞毒性作用占主导地位,导致NF-κB信号途径及食道癌细胞增殖被抑制.