晋麦47幼苗中一个水分胁迫应答蛋白的SDS-PAGE和Nano LC-MS/MS鉴定

水分胁迫应答蛋白的表达与小麦品种的抗旱性密切相关。为了明确与抗旱相关的水分胁迫D-应答蛋白的表达特点及蛋白组成,对小麦品种晋麦47幼苗进行不同供水量处理,应用SDS-PAGE、纳升级液相色谱-电喷雾串联质谱联用技术(Nano LC-MS/MS),分析了水分胁迫D-应答蛋白条带表达量的变化和蛋白组成。SDS-PAGE检测结果表明,水分胁迫D-应答蛋白条带在-0.5 MPa PEG-6000水溶液胁迫下,6 h出现可见表达,胁迫至48 h时表达量最大,之后,此蛋白条带的表达量又逐渐下降;幼苗胁迫48 h后恢复正常供水,复水72 h后该蛋白消失。切取正常供水和胁迫处理两个条件下SDS-PAGE胶差异表达蛋白条带,经质谱分析分别获得两个阳性结果,且正常供水和PEG-6000胁迫两种处理条件下D-应答蛋白组成一致,均由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基和磷酸甘油酸变位酶组成(P<0.05);PEG-6000胁迫条件下两个蛋白(亚基)的鉴定得分分别为1 632和88,覆盖率分别为30%和21%;在鉴定的肽段中,有65个肽段同属于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基,其中35个肽段可信度均超过阈值分数;有5个肽段同属于磷酸甘油酸变位酶,其中4个肽段的可信度超过阈值分数。结果表明该蛋白条带可能主要由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基等组成。

晋麦47幼苗叶片水分胁迫差异表达蛋白的鉴定与分析

为了从蛋白质水平进一步揭示小麦抗旱机理,以旱地小麦品种晋麦47为试验材料,采用蛋白质双向电泳技术,结合质谱鉴定技术,研究幼苗在正常供水与水分胁迫(-0.5 MPa的PEG-6000溶液处理48h)后叶片蛋白质组表达谱间的差异,分析水分胁迫差异表达的蛋白种类及其功能。研究发现,在正常供水和水分胁迫处理两种条件下,幼苗叶片蛋白的双向电泳图谱均可重复检测到850个蛋白点;31个蛋白点在两种供水水平间表达量存在显著差异,其中17个蛋白点在水分胁迫处理下表达量明显增加,14个蛋白点表达量明显减少。对这些蛋白点进行肽指纹图谱分析,并利用Mascot软件在NCBInr数据库搜索,最终有26个蛋白点被成功鉴定;其中,未知功能蛋白7个;已知功能蛋白19个,主要涉及能量、代谢、抗病与防御、细胞结构、转录与翻译以及信号转导等功能类别。结果表明,小麦体内的多个代谢及调控途径参与了对干旱的应激反应。最后,本文还对鉴定到的差异蛋白点与水分胁迫的关系进行了分析和讨论。

一个水分胁迫应答蛋白与小麦抗旱性的关系及其基因的定位

分析与小麦抗旱性密切相关的水分胁迫应答蛋白,定位蛋白基因并挖掘与其连锁的分子标记对小麦抗旱分子辅助选择具有重要意义。在一年两点田间全生育期抗旱性鉴定基础上,以-0.5 MPa PEG-6000模拟干旱胁迫处理小麦幼苗48 h,并应用SDS-PAGE方法检测分子量约66.2 kD的水分胁迫应答蛋白,分析其表达与小麦抗旱性的关系。在128个小麦品种(系)中,检测出67份表达该蛋白,另61份未表达该蛋白;前者的平均抗旱指数为1.00,而后者为0.80,有极显著差异(P<0.01),且各抗旱性等级中表达该蛋白的品种比例随着抗性等级的降低而减小。利用晋麦47×西农2208杂交后代230个F3株系进行遗传分析,发现该蛋白表达由1对显性基因控制;目的基因与位于小麦5AS染色体上的5个SSR标记(Xgwm129、Xgwm304、Xbarc56、Xbarc117和Xbarc197)连锁,位于邻近标记Xbarc56和Xbarc117之间,遗传距离分别为2.2 cM和2.9 cM。用这2个紧密连锁标记检测128个小麦品种(系),有67个品种(系)与晋麦47具有相同的标记位点,其中86.6%的品种(系)(58/67)在水分胁迫后表达目标蛋白。该约66.2 kD的水分胁迫应答蛋白与小麦的抗旱性密切相关,与其紧密连锁的分子标记可为小麦抗旱分子辅助选择提供依据。

HMW-GS分子标记多重PCR体系的建立及新疆春小麦的检测

为给新疆优质春小麦品种选育提供参考依据,利用小麦优质高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)基因的特异性标记,基于17份已知HMW-GS组成的品种(系),构建了3套多重PCR,体系Ⅰ可用于同时检测AxNull和Dx5基因,体系Ⅱ可同时检测Ax2*和By8基因,体系Ⅲ可同时检测Bx14和Dx5基因;用3套多重PCR体系分别检测17份小麦品种,其结果与SDS-PAGE检测结果完全一致,表明建立的3套多重PCR体系稳定可靠,可用于小麦品种优质HMW-GS基因聚合育种。利用此体系对85份新疆春小麦品种进行分析表明,AxNull和Ax1的频率均为24.7%,Ax2*为50.6%,By8为48.2%,Bx14(+By15)为0%,Dx5(+Dy10)为34.1%。

苗期水分胁迫应答蛋白与小麦品种(系)水旱生态型的关系

为了解苗期水分胁迫应答蛋白表达与小麦品种(系)水旱生态型间的关系,以150份不同水旱生态型的小麦品种(系)为材料,采用正常供水和-1.0 MPa PEG-6000胁迫分别处理其幼苗72 h后,应用SDS-PAGE方法检测叶片内分子量为66.2 kDa左右的应答蛋白在不同品种(系)内的表达,分析该表达蛋白与品种(系)所属生态型的关系。在水分胁迫与非胁迫两种方式处理幼苗后,该蛋白的表达在供试品种(系)间存在三种类型:25份品种(系)在两种供水条件下均表达该蛋白,占参试品种(系)的16.7%;58份只在水分胁迫条件下表达该蛋白而在非胁迫条件不表达该蛋白,占38.7%;其余67份品种(系)在两种供水条件下都不表达该蛋白,占44.6%。通过对品种(系)水分胁迫应答蛋白的三种表达类型与其所属水、旱、水旱生态型的相关分析表明,该蛋白表达的类型与品种(系)水旱生态型间存在极显著的相关;这说明苗期水分胁迫应答蛋白的表达与品种(系)抗旱性密切相关,该蛋白在不同水分条件下表达与否可作为品种(系)抗旱性鉴定的一项指标。

4套强筋小麦HMW-GS多重PCR体系的构建

小麦高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)组成与其加工品质密切相关,建立其相关简便有效的遴选体系对小麦品质评价和优质品种选育具有重要意义。本研究选用对小麦品质有重要影响的HMW-GS基因的特异性分子标记,基于26份已知HMW-GS组成的小麦品种(系)检测验证基础上,建立强筋小麦HMW-GS基因的多重PCR检测体系。已建立了4套多重PCR体系:体系Ⅰ同时检测Axnull与By8基因,体系Ⅱ检测By8与Dx5基因,体系Ⅲ同时检测Axnull、By8与Dx5基因,体系Ⅳ同时检测Axnull、Bx14与Dx5基因。利用每个体系对26份品种(系)进行检测,其结果与已知结果一致,说明创建的4套多重PCR体系稳定结果可靠,可用于强筋小麦品种的分子辅助选择和品质评价。