去氢骆驼蓬碱及其衍生物DH-004暴露对小鼠神经系统毒性作用研究

目的:研究去氢骆驼蓬碱(harmine,HM)及其衍生物1-(4-甲氧基)苯基-9-丁基-β-咔啉(DH004)对脑神经毒性的作用。方法:免疫吸附测定法(ELISA)测定小鼠脑组织中IL-1β,TNF-α,IL-12和IL-6含量;尼氏染色法检测小鼠大脑皮质神经细胞形态改变;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法(qRT-PCR)检测脑组织中离子钙接头蛋白(ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)基因的表达水平;蛋白免疫印迹法(Western-Blot)检测脑组织中Iba-1蛋白的表达水平。结果:ELISA实验结果显示,除了IL-6因子在各剂量组的含量变化不明显,其余3个因子HM处理组小鼠脑组织中的表达量最高,给予相同剂量的DH-004后,与HM处理组相比,小脑组织中炎症因子表达出现显著下降(P<0.01)。尼氏染色、qRT-PCR、WesternBlot实验结果显示,与空白组相比,HM给药组对小鼠皮质神经细胞损伤严重,且有剂量依赖性;HM组Iba1mRNA和Iba-1蛋白表达水平较相应的空白组明显上调(P<0.01),给予相同剂量的DH-004后,与HM处理组相比,小脑组织中Iba-1mRNA和Iba-1蛋白表达水平显著下调(P<0.01)。结论:HM可能诱导小鼠小胶质细胞的活化,激活的小胶质细胞促使炎症因子释放增加,导致神经组织损伤;而DH-004可能抑制小胶质细胞活化,从而减少炎症因子释放,减轻神经毒性。

去氢骆驼蓬碱衍生物DH-004在不同介质中平衡溶解度、油水分配系数及解离常数的测定

目的:测定DH-004在不同溶剂中的平衡溶解度、表观油水分配系数(lgP)和解离常数(pKa),为药物的生物药剂学分类系统(BCS)分类及体内吸收剂型设计提供依据。方法:采用高效液相色谱法(highperformance liquid chromatography,HPLC)测定DH-004在不同溶剂和表面活性剂溶液中的浓度,采用摇瓶法测定DH-004在正辛醇-水/缓冲盐中油水分配系数,用紫外分光光度法测定pKa。结果:37℃时DH-004在水中的平衡溶解度为18.42 mg·mL^-1,在有机溶剂中的溶解度顺序为正丁醇>丙酮>乙醇>甲醇>三氯甲烷>乙酸乙酯;在pH 1.2和4.5缓冲液中的平衡溶解度较水中有明显增加,pH 2.5,5.0和6.8范围内平衡溶解度较水中降低,pH 5.8和7.0条件下平衡溶解度与水中相当,pH 7.8不能检测出吸收峰。质量浓度0.1 g·mL^-1的聚乙二醇4000(PEG4000)和泊洛沙姆188(Poloxamer188)有较强的增溶效果。DH-004表观正辛醇/水分配系数为11.6(lgP=1.06);在pH 1.2~7.8的介质中,pH 7.8的磷酸盐缓冲液中表观油水分配系数最大为20.24(lgP=1.31),pH 7.0时其油水分配系数与在水中相当,pH为2.5,4.5,5.0,5.8和6.8条件下lgP无明显变化。DH-004解离常数pKa为7.08。结论:DH-004为低溶解性,渗透性较好的药物,其主要口服吸收部位可能在小肠,且pH能影响平衡溶解度和表观油水分配系数,本研究可以佐证其属于生物药剂学分类系统中的Ⅱ类药物,为DH-004的开发利用提供了相应的实验依据。

细粒棘球绦虫Rad54基因的生物学分析及其在不同发育阶段表达检测

目的对EgRad54基因进行生物信息学分析,并对细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达情况进行检测分析。方法克隆EgRad54基因并对编码产物的理化性质、二、三维结构进行预测和分析;采用MEGA5.0软件构建系统进化树并进行分析;采用qRT-PCR检测细粒棘球绦虫不同发育阶段的EgRad54 mRNA的表达水平。结果 EgRad54基因开放阅读框长度为1 714 bp,NCBI blast比对显示其序列与原始序列相似性为100%,DNAMAN比对相似性为95.40%;EgRad54蛋白含有581个氨基酸,相对分子质量为65.520 45×10^3,理论等电点为8.91;在EgRad54蛋白二级结构中,ɑ-螺旋占44.41%,β-折叠占13.25%,β-转角占6.37%,无规则卷曲占35.97%;三级结构选择123i.A模型,GMQE为0.78,QMEAN为-3.51,序列相似度为69.33%,覆盖率为85.20%;进化树显示EgRad54基因与多房棘球蚴亲缘关系较近;以未消化原头蚴组作为对照组,qRT-PCR检测胃蛋白酶消化原头蚴组和囊泡组Rad54基因相对表达量分别为1.126±0.068和1.111±0.073,差异无统计学意义(F=4.034,P>0.05)。结论成功克隆出细粒棘球绦虫原头蚴Rad54基因,其编码EgRad54蛋白二级结构主要为ɑ-螺旋。该基因在细粒棘球绦虫原头蚴及棘球蚴期不同发育阶段均有表达。