结膜下注射间充质干细胞对大鼠角膜移植物生存的影响

背景 间充质干细胞（MSCs）已用于多种器官移植抗排斥反应的基础和临床研究.我们先前的研究表明,鼠尾静脉注射MSCs可延长大鼠角膜植片的存活时间,但治疗时MSCs的需求量较大且存在一定的全身不良反应.眼局部应用MSCs是否能够替代角膜移植排斥反应的全身治疗尚不清楚. 目的 探讨结膜下注射骨髓MSCs对大鼠角膜移植排斥反应的作用.方法 从清洁级Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓中分离获得MSCs进行培养和传代,以体外成骨细胞分化和脂肪细胞分化法进行鉴定,取第3代MSCs用于实验.将20只Wistar大鼠双眼角膜作为角膜供体植片,40只Lewis大鼠右眼作为受体植床,行同种异体穿透角膜移植术.应用随机数字表法将40只受体大鼠分为PBS对照组和MSCs治疗组,另取6只正常Lewis大鼠作为正常对照组.MSCs治疗组大鼠分别于角膜移植术后即刻和第3天结膜下注射含2＆#215;106 MSCs的PBS 0.1 ml,PBS对照组大鼠以同样的方法仅给予等容积PBS.各组大鼠术后每天裂隙灯显微镜下观察角膜植片的混浊、水肿和新生血管情况,并按角膜植片排斥反应标准进行评分.于术后第10天分别处死PBS对照组和MSCs治疗组各12只大鼠,取出术眼角膜组织,采用实时荧光定量PCR法检测Th1细胞相关炎性因子γ干扰素（IFN-γ）mRNA和白细胞介素-2（IL-2）mRNA及Th2细胞相关炎性因子IL-4 mRNA和IL-10 mRNA在角膜中的相对表达量;采用ELISA法检测角膜组织中Th2细胞相关因子IL-4和IL-10蛋白的质量浓度. 结果 培养的细胞生长良好,成骨细胞分化的细胞茜素红染色呈橘黄色,脂肪细胞分化的细胞油红O染色呈红色,证实为MSCs.角膜移植术后MSCs治疗组角膜植片存活时间为（11.8±1.6）d,长于PBS对照组的（9.6±1.4）d,差异有统计学意义（P=0.004）;MSCs治疗组大鼠角膜植片中IFN-γmRNA、IL-2 mRNA的相对表达量较PBS对照组下降,但2个组间差异均无统计学意义（均P＞0.05）,但IL-4 mRNA和IL-10 mRNA相对表达量明显高于PBS对照组,差异均有统计学意义（均P=0.00）.正常对照组、PBS对照组和MSCs治疗组大鼠角膜植片中IL-10蛋白质量浓度分别为（22.74±7.06）、（68.40±12.83）和（215.41±44.66） pg/ml,3个组间总体比较差异有统计学意义（F=55.06,P=0.00）,且MSCs治疗组大鼠植片中IL-10蛋白质量浓度明显高于PBS对照组及正常对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.结论 结膜下注射MSCs可以延长大鼠异体穿透角膜移植术后植片的存活时间,这一作用可能是通过调节Th 1/Th2平衡,特别是上调Th2细胞因子而介导的.

有关生殖性克隆与治疗性克隆伦理的研究进展

科学技术的巨大进步使医学获得了一系列前所未有的成绩，创造了一个又一个的奇迹。如今，克隆技术已经历了3个发展时期：从最初的用一个细菌复制出成千上万和它一模一样细菌群的微生物克隆，到用遗传基因DNA克隆的生物技术克隆，再到克隆绵羊“多利”的诞生，克隆技术已经由单纯的生殖性用途向治疗性用途扩展，形成了治疗性克隆的新领域。

α-黑素细胞刺激素对早期糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的保护作用

背景 糖尿病视网膜病变（DR）的主要病理基础是视网膜的微血管变化和炎性改变.研究认为α-黑素细胞刺激素（α-MSH）玻璃体腔注射可对视网膜脉络膜组织发挥抗氧化应激和抗凋亡作用,从而改善血-视网膜屏障（BRB）功能,但缺乏组织学研究的验证.目的 研究α-MSH对视网膜血管渗漏的改善作用.方法 应用随机数字表法将清洁级SD大鼠90只随机分为正常对照组、糖尿病（DM）模型组和α-MSH组,DM模型组和α-MSH组大鼠采用尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）法制备模型,正常对照组大鼠同法注射枸橼酸钠缓冲液.α-MSH组大鼠分别于造模后1周和3周玻璃体腔注射3.3 μg/μl α-MSH 3 μl,正常对照组大鼠同法注射生理盐水3μl,DM模型组不行玻璃体腔注射.造模后第5周,按照45 mg/kg的剂量经鼠尾静脉注射30 mg/ml伊文思蓝溶液,注射后2h每组取2只大鼠制备视网膜铺片,于荧光显微镜下观察视网膜血管形态;收集各组8只大鼠内眦部血液,检测BRB渗漏状况;用37℃枸橼酸钠缓冲液行左心室灌流,处死大鼠,分离大鼠视网膜,透射电子显微镜下观察脉络膜和视网膜血管超微结构的变化;采用实时定量PCR法检测细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、闭合蛋白（occludin）和血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的相对表达水平.结果 DM模型大鼠体质量明显降低,饮水量明显增多;造模后3d和5周,DM模型组大鼠的血糖分别为（29.69±4.77） mmol/L和（24.64±2.72） mmol/L,DM模型成功建立.视网膜铺片显示,DM模型组大鼠视网膜血管走行异常,血管壁大量伊文思蓝渗漏,而α-MSH组大鼠视网膜血管形态接近正常对照组.造模后5周,DM模型组大鼠视网膜伊文思蓝的渗漏量为（10.04±8.18） μl/（g·h）,明显多于α-MSH组的（2.62±3.73） μl/（g·h）和正常对照组的（3.10±1.13） μl/（g·h）,差异均有统计学意义（P=0.035、0.041）.α-MSH组大鼠脉络膜和视网膜血管的超微结构接近正常对照组,而DM模型组大鼠脉络膜血管内皮细胞肿胀,视网膜色素上皮（RPE）空泡样变性.此外,DM模型组大鼠视网膜中ICAM-1 mRNA和TNF-αmRNA水平明显高于α-MSH组和正常对照组,而occludin mRNA的相对表达水平明显低于o-MSH组和正常对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.3个组大鼠视网膜中VEGF mRNA相对表达量的整体比较,差异无统计学意义（F=0.791,P=0.466）.结论 在STZ诱导的DM模型大鼠中,玻璃体腔注射α-MSH可通过减少视网膜血管的渗漏,改善脉络膜和视网膜血管的超微结构,下调视网膜中促炎因子的表达和上调细胞间紧密连接成分的表达发挥对视网膜的保护作用.

α-黑素细胞刺激素联合羧甲基纤维素钠对干眼大鼠眼表的保护作用

背景研究表明，α-黑素细胞刺激素（α—MSH）具有抗炎作用，可缓解氢溴酸东莨菪碱诱导的大鼠干眼模型的眼表异常，而人工泪液羧甲基纤维素钠（CMC）能够润滑干眼眼表，但α-MSH能否在大鼠干眼模型中促进人工泪液CMC的治疗效果尚有待进一步研究。目的探讨α-MSH联合CMC对氢溴酸东莨菪碱诱导的大鼠干眼模型中眼表的保护作用。方法选取清洁级雌性Wistar大鼠60只，采用随机数字表法随机分为正常对照组、模型对照组、NaCI点眼组、CMC点眼组、α—MSH点眼组和OL—MSH＋CMC点眼组，每组10只。除正常对照组外，其他各组大鼠分别于每日9：00、12：00、15：00、18：00接受0．5ml（6mg／m1）氢溴酸东莨菪碱皮下注射，共28d，以诱导干眼模型，NaCl点眼组、CMC点眼组、α-MSH点眼组和α—MSH＋CMC点眼组于注射后第1天分别用质量分数0．9％NaCl溶液、质量分数0．5％CMC滴眼液、1×10^-3 mg／mlα-MSH溶液、1×10^-3mg／mld—MSH＋0．5％CMC混合液点右眼，每日2次（8：00和17：00）。各组大鼠分别于用药后0、7、14、21和28d行Shirmer试验I检测（SIt）、泪膜破裂时间（BUT）检测、角膜上皮荧光素染色评分，并于用药后28d完成检查后处死，取包含上下眼睑的整个大鼠眼球，取角膜组织行苏木精一伊红染色，光学显微镜下观察大鼠角膜的形态学变化，大鼠结膜组织行过碘酸希夫染色，光学显微镜下观察各组大鼠结膜杯状细胞的数量。结果随着造模后时间的延长，大鼠sIt值和BUT值逐渐下降，角膜荧光素染色评分逐渐增加，造模后各时间点模型对照组与正常对照组比较，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。大鼠用药后7、14和21和28d，NaCl点眼组SIt值、BUT值和角膜荧光素染色评分与模型对照组比较，差异均无统计学意义（均P〉0．05）。用药后7、14和21d，仅-MSH＋CMC点眼组大鼠Sit值分别为（4．800±0．789）、（4．100±0．516）和（4．300±0．856）mm，明显高于相应时间点NaCl点眼组的（2．875±0．719）、（2．375±0．619）和（2．532±0．957）mm，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。用药后7d，n—MSH点眼组和α-MSH＋CMC点眼组的BUT值分别为（4．938±1．843）S和（5．000±1．491）s，明显高于NaCl点眼组的（3．250±1．000）S，差异均有统计学意义（均P〈O．01）。用药后各时间点CMC点眼组、α-MSH点眼组和α—MSH＋CMC点眼组大鼠角膜荧光素染色评分均明显低于NaCl点眼组，差异均有统计学意义（均P〈0．05），以α-MSH＋CMC点眼组角膜荧光素染色评分最低。苏木精一伊红染色显示，模型对照组和NaCl点眼组大鼠出现角膜上皮层增厚、角膜水肿、角膜上皮粗糙和角膜基质层纤维排列紊乱，α—MSH＋CMC点眼组大鼠角膜水肿和上皮细胞的增生轻微，角膜形态接近正常对照组。大鼠结膜组织过碘酸希夫染色显示，CMC点眼组、α-MSH点眼组和α-MSH＋CMC点眼组大鼠结膜杯状细胞数量明显多于模型对照组和NaCl点眼组（均P〈0．01）。结论单独使用α—MSH和CMC可一定程度上改善干眼大鼠的角膜组织损伤、角膜形态学异常以及结膜杯状细胞数量的减少，但相对于单独用药，α—MSH和CMC联合应用在造模后早期对改善干眼模型大鼠泪液分泌量和泪膜稳定性作用更明显。

角膜接触镜屈光度含水量在连续日戴中对眼表影响

目的 研究不同含水量、不同屈光度的角膜接触镜对眼表的影响.方法 对2012年5～12月在天津医科大学眼科医院收集的屈光不正患者29例58只眼,按球镜屈光度分为低度组（14只眼）、中度组（15只眼）和高度组（29只眼）共3组.其中高度组按随机数字表法又分为两组,一组（15只眼）与低、中度组均配戴高含水（55％）角膜接触镜;另一组（14只眼）配戴低含水（38％）角膜接触镜.各组分别于配戴前、配戴后1、3、6个月检查其角膜中央厚度、泪液分泌量及泪膜破裂时间,观察角膜接触镜对眼表的影响.结果 低、中度组在配戴高含水量镜片后,角膜厚度、泪液分泌量及泪膜破裂时间在各时期差异比较均无统计学意义（P＞0.05）;高度组配戴高含水镜片后角膜明显变薄,差异比较具有统计学意义（P＜0.05）,泪液分泌量在1、3个月时较配戴前下降,具有统计学意义（P＜0.05）,泪膜破裂时间在3、6个月时较配戴前缩短,具有统计学意义（P＜0.05）;高度组配戴低含水量镜片后角膜变薄,且在1个月时配戴高含水镜片者变薄程度大,差异比较均具有统计学意义（P＜0.05）,泪液分泌量在各时期无明显变化,泪膜破裂时间在3、6个月时较配戴前缩短,且与配戴高含水镜片的变化在各时期差异比较无统计学意义（P＞0.05）.结论 低、中度屈光不正者在短期配戴角膜接触镜,其角膜生理状态变化不明显.高度屈光不正者在配戴过程中会出现角膜变薄、泪液分泌量减少、泪膜破裂时间缩短,且镜片含水量的增加会加重以上变化.高度屈光不正者在配戴角膜接触镜时要更加注重镜片参数和设计以及配戴方式和时间.

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对体外培养的视网膜色素上皮细胞磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路的调控作用

目的：观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）对体外培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路的调控作用。方法将体外培养的 RPE 细胞分为 PSF 高表达组、PSF 高表达对照组、PSF 低表达组、PSF 低表达对照组及假转染组。应用脂质体2000将上调 PSF 表达的真核质粒增强型绿色荧光蛋白（pEGFP）-C2-PSF、下调 PSF 表达的真核质粒 pGenesil-PSF-RNAi 以0.25、0.50、1.00μg 的递增量分别转染至 PSF 高表达组及 PSF 低表达组细胞。PSF 高表达对照组细胞转染 pEGFP-C2空载质粒。PSF 低表达对照组细胞转染 pGenesil-scramble-siRNA 质粒。假转染组仅做转染处理,不加入任何表达质粒。采用水溶性四氮唑法检测胰岛素样生长因子1（IGF-1）刺激条件下 PSF 对 RPE 细胞增生的影响。应用脂质体2000将0.50μg 真核质粒pEGFP-C2-PSF、1.00μg 真核质粒 pGenesil-PSF-RNAi 及 pEGFP-C2空载质粒转染细胞分别作为 PSF 高表达组、PSF 低表达组、对照组,采用实时定量聚合酶链反应（PCR）检测 PSF 对 IGF-1诱导的 RPE 细胞内血管内皮生长因子（VEGF）mRNA 表达的影响。采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 PSF 对 IGF-1诱导的磷酸化 Akt （pAkt）蛋白表达的影响。在 IGF-1刺激后,将 RPE 细胞分为单纯渥曼青霉素（Wortmannin）处理组、单纯 PSF 高表达组、渥曼青霉素联合 PSF 高表达处理组,并以未经渥曼青霉素处理的常规体外培养的 RPE 细胞为对照组,采用实时定量 PCR 检测各组 VEGF 的表达。结果IGF-1刺激后,PSF 高表达组、PSF 高表达对照组及假转染组之间 RPE 细胞增生率比较,差异有统计学意义（F =29.728,P 〈0.05）；PSF 低表达组、PSF 低表达对照组及假转染组之间 RPE 细胞增生率比较,差异有统计学意义（F =14.121,P〈0.05）。PSF 高表达组 RPE 细胞中 VEGF mRNA 表达较对照组明显降低,差异有统计学意义（P =0.0003）；PSF 低表达组 RPE 细胞中 VEGF mRNA 表达较对照组明显提高,差异有统计学意义（P =0.0309）。Western blot 检测结果显示,IGF-1刺激可上调 pAkt 蛋白表达水平,PSF 高表达可明显下调 pAkt 蛋白表达水平。IGF-1刺激后,渥曼青霉素联合 PSF 高表达处理组 VEGF 表达较单纯渥曼青霉素处理组明显降低,差异有统计学意义（P 〈0.05）。结论PSF 能抑制 IGF-1刺激后体外培养的 RPE细胞中 PI3K/Akt 信号通路活化,下调 VEGF 表达。

微RNAs在角膜的表达和功能

微RNAs是近20年来发现的一类长度为21～ 25个核苷酸的非编码蛋白质的单链小RNA,其普遍存在于生物基因组内,通过与靶mRNA的3 ＇端非翻译区结合,在转录后和翻译水平调控基因表达.在眼部有200余种微RNAs表达,其中角膜可表达50余种.微RNAs在角膜的发育、分化、糖原代谢、损伤后修复以及稳态维持过程中具有重要的作用;此外,微RNAs在圆锥角膜、角膜移植后免疫排斥反应、单纯疱疹病毒感染及碱烧伤引起的新生血管形成等病理过程中也起到调控作用.因此,微RNAs在角膜中以组织特异性方式表达并调控角膜的生理、病理过程,研究微RNAs在角膜中的表达和调控将为探索角膜疾病的发病机制和新型治疗靶点提供理论依据.

富氢盐水对大鼠干眼模型眼表的保护作用

目的 探讨富氢盐水对东莨菪碱诱导的大鼠干眼模型眼表的保护作用.方法 实验研究.6周龄Wistar健康雌性大鼠30只（60只眼）,随机数字表法分为正常对照组、干眼组、富氢盐水滴眼组、生理盐水滴眼组、富氢盐水腹腔注射组和生理盐水腹腔注射组,每组各5只（10只眼）.皮下注射东莨菪碱制备干眼模型,并于7、14、21、28 d对各组大鼠行泪液分泌试验（SⅠt）、泪膜破裂时间（BUT）、角膜上皮荧光素钠染色评分.于28 d制作眼球石蜡切片,行HE染色、过碘酸-雪夫（PAS）染色及免疫组织化学染色.采用两因素重复测量方差分析比较各组不同时间点整体上的差异,采用单因素方差分析比较各组间同一时间点的差异,进一步两两比较采用LSD检验.结果 实验前及实验后7、14、21、28d的SⅠt值在富氢盐水滴眼组和富氢盐水腹腔注射组分别为（3.625±1.157）、（3.313±0.704）、（3.250±0.535）、（3.313±0.372）、（3.375±0.582）mm和（3.500±1.019）、（2.893±0.656）、（3.321±0.668）、（3.179±0.575）、（3.214±0.871）mm;BUT值分别为（2.750±0.707）、（2.688±0.594）、（2.813±0.753）、（3.000±0.756）、（2.750±0.707）s和（3.000±0.679）、（2.321±0.464）、（2.750±0.753）、（3.214±0.699）、（2.679±0.608）s;角膜上皮荧光素钠染色评分分别为（6.250±0.707）、（8.875±0.641）、（8.750±0.707）、（9.250±0.463）、（8.250±1.282）分和（6.000±0.679）、（9.143±1.027）、（8.857±0.770）、（9.143±0.949）、（8.500±0.760）分.14 d时各组大鼠的SⅠt、BUT、荧光素钠染色评分差异有统计学意义（F=5.194,3.894,16.487;P〈0.05）;富氢盐水滴眼组和生理盐水滴眼组相比,差异均有统计学意义（P〈0.05）;富氢盐水腹腔注射组和生理盐水腹腔注射组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）;富氢盐水滴眼组和富氢盐水腹腔注射组相比,差异无统计学意义（P〉0.05）;至28 d始终保持稳定.28 d时取眼球,行HE染色、PAS染色和免疫组化染色,结果示富氢盐水滴眼组和富氢盐水腹腔注射组大鼠角结膜上皮均变平整规则,细胞层次减少,水肿减轻,杯状细胞大小趋于正常,鳞状上皮化生和炎性反应程度减轻.结论 富氢盐水滴眼或腹腔注射均可缓解大鼠干眼体征,改善大鼠角结膜组织病理损伤;从用药14 d起富氢盐水对干眼大鼠眼表的保护作用明显优于生理盐水.

干眼新型干预手段的研究进展及其对眼表微环境的保护作用机制

干眼新型干预手段的研究主要集中在维持眼表微环境平衡，包括对抗炎症方面的降低炎性因子表达和新型的损伤相关分子模式，对抗氧化应激方面的维持氧化酶和抗氧化酶平衡和激活内质网应激反应，以及通过增加黏蛋白、脂质含量维持泪膜稳定性三个方面。