负载酪氨酸酶抑制肽的牛奶外泌体抑制酪氨酸酶活性及黑色素生成研究

目的:探讨酪氨酸酶抑制肽(YRS)功能化的牛奶外泌体(mEXOYRS),对酪氨酸酶活性及黑色素生成的抑制作用。方法:通过超速离心法获取牛奶外泌体(mEXO);利用外泌体特异锚定肽CP05将YRS修饰在mEXO表面,获得mEXOYRS,随后通过流式细胞仪分析YRS的负载效率;在黑色素瘤细胞B16-F10中,检测细胞对mEXOYRS的摄取效率以及YRS与酪氨酸酶的共定位效率,评估mEXOYRS对B16-F10黑色素瘤细胞酪氨酸酶活性的抑制效果及对黑色素合成的抑制作用;进一步将mEXOYRS均匀涂抹于Nude BALB/c小鼠黑色素瘤细胞B16-F10所成皮下瘤模型上,评估其在体内对黑色素合成的抑制作用;通过对C57BL/6小鼠表面皮肤涂抹mEXOYRS,评估其对小鼠毛囊的着色程度及小鼠皮肤的美白效果。结果:YRS通过外泌体特异锚定肽CP05高效负载至mEXO,并且不影响mEXO的形态结构及标志性蛋白的表达;在B16-F10黑色素瘤细胞摄取实验中,mEXO能够增强YRS与细胞内酪氨酸酶共定位的效率,在1周、2周及6周时均显著抑制细胞产生黑色素(F=56.117、48.954、560.006,均P<0.05);在Nude BALB/c小鼠黑色素皮下瘤模型中,与YRS组相比,mEXOYRS更好的抑制了黑色素的产生;在C57BL/6小鼠模型中,mEXOYRS降低了黑色素的产生,并显著降低了黑色素含量(F=173.083,P<0.05)及酪氨酸酶活性指标(F=34.156,P<0.05),取得了美白效果。结论:YRS修饰的mEXO可通过内体转运途径,靶向运输到酪氨酸酶处,降低酪氨酸酶活性,并有效抑制黑色素生成,提高YRS的美白效果。

Trim72基因在肝癌转移中的功能研究

目的利用CRISPR—Cas9基因编辑技术验证与非小细胞肺癌转移相关的Trim72基因的敲除是否引起肝癌转移能力的变化。方法建立稳定表达Cas9蛋白的小鼠肝癌细胞系Hepa1－6（Cas9），随后利用针对Trim72基因的单导向RNA（sgRNA）进行特异性基因敲除获得Hepa1－6（Trim72-KO）细胞系，再通过体外bTranswell实验和体内皮下瘤肺转移检测评估该细胞系的迁移和侵袭能力。结果利用CRISPR-Cas9系统成功获得了Hepal－6（Trim72－KO）细胞系。Transwell实验结果表明，敲除％m72基因后，Hepa1－6（Cas9）细胞系的体外迁移和侵袭能力增强；体内皮下瘤肺转移病理检查结果显示，Hepa1－6（Trim72－KO）细胞系（实验组）所成皮下瘤的体内转移能力明显强于未转入相应sgRNA的Hepa1－6（Cas9）细胞系（对照组）。结论通过CRISPR-Cas9系统成功获得了敲除Trim72基因的Hepa1-6（Trim72-KO）细胞系，该细胞系表现出较Hepa1-6（Cas9）细胞系更强的侵袭和转移能力，说明Trim72基因可能在肝癌的侵袭和转移中起重要作用，有望成为肝癌基因治疗的潜在靶点。

两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较

为了比较两种不同的原核表达载体体外表达纯化CP05-GFP蛋白的能力,本研究通过构建pET28b-CP05-GFP(双His-Tag)、pET28b-CP05-GFP(单His-Tag)、pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)三个原核表达质粒,诱导表达并纯化带有不同标签的CP05-GFP蛋白。通过考马斯亮蓝染色技术比较两种不同的原核表达载体表达以及体外纯化CP05-GFP蛋白的能力,发现3个原核表达载体均能诱导表达出CP05-GFP蛋白,且能纯化出CP05-GFP蛋白,但是不同标签纯化CP05-GFP蛋白的纯化效率是不同的:pET28b-CP05-GFP(双His-Tag)原核表达系统能够表达并纯化出CP05-GFP蛋白,但其表达量低易纯化;pET28b-CP05-GFP(单His-Tag)原核表达系统能够表达并纯化出CP05-GFP蛋白,其表达量高但不易纯化;pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)原核表达系统可表达出足量的CP05-GFP(GST-Tag)蛋白,并且易纯化。本研究有助于选择合适的载体进行融合蛋白的表达和纯化。