拉曼光谱分析技术在细胞生物学研究中的应用进展

细胞是生物体结构和功能的基本单位,自被发现以来新的研究方法不断涌现。单细胞拉曼光谱能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质含量等大量信息,可在不损伤细胞的条件下实时动态地监测细胞分子结构变化,亦可获得细胞的"分子指纹",具有敏感性高、实时检测、活样品不需固定或染色、不损伤细胞等众多特点。近年来国内外研究者将拉曼光谱应用于细胞药物处理、细胞水平疾病诊断、单细胞生命活动监测、亚细胞结构等研究,取得了不同程度的进展。随着研究的深入,拉曼光谱分析技术必将在于细胞,癌症研究、细胞分选、药物筛选等领域大有作为。

基于思维导图填空复习法在诊断学见习教学中的应用

目的:探讨基于思维导图填空复习法对诊断学成绩的影响。方法:将一个班临床医学专业见习学生分为实验组和对照组,在期末对照组采用传统教师讲解复习,实验组在传统讲解的基础上增加思维导图填空课堂练习。统计分析两组期末理论成绩。结果:实验组理论成绩显著优于对照组。进一步分析显示两组简答题得分未见明显差异,而实验组在选择题及论述题成绩显著优于对照组。相关分析显示思维导图填空复习法与选择题成绩、论述题成绩和总成绩显著相关。结论:基于思维导图填空复习法结合传统讲解可提高学生诊断学的理论成绩。

塞来昔布预防唑来磷酸治疗老年性骨质疏松症不良反应的疗效观察

目的探讨预防应用塞来昔布是否可以减少使用唑来磷酸治疗老年性骨质疏松症不良反应的发生。方法选取2012年1月至2015年1月老年性骨质疏松症患者116例,年龄61~86岁。依据输注唑来磷酸前是否预防应用塞来昔布及布洛芬分为空白对照组、布洛芬组、塞来昔布组。观察输注唑来磷酸过程中及输液后3 d内不良反应发生的情况。结果 （1）塞来昔布组发热比例最少,塞来昔布组7例（14%）、布洛芬组8例（25%）、空白对照组13例（38.2%）。（2）中热（38.1-39℃）、高热（〉39℃）的塞来昔布组比例显著低于其他两组,而低热（37.3-38℃）的塞来昔布组比例略高于其他两组。各组在不同发热程度的比例分别为：塞来昔布组：低热4例（8%）、中热2例（4%）、高热1例（2%）;布洛芬组：低热3例（6.3%）、中热3例（9.4%）、高热3例（9.4%）;空白对照组：低热2例（5.9%）、中热5例（14.7%）、高热6例（17.6%）。三组发热程度比较有显著性差异（P〈0.05）。（3）肌肉痛、骨骼关节疼痛、流感样症状、消化道症状、头晕、头痛、心悸等不良反应发生率均为塞来昔布组最低。除心悸、皮疹外,其他不良反应发生率在三组间均有显著性差异（P〈0.05）。结论预防性应用塞来昔布可以减少唑来磷酸不良反应的发生。

金花茶对衰老大鼠的抗氧化和抗凋亡作用

目的探讨金花茶对亚急性衰老大鼠抗氧化和抗凋亡的作用。方法拟建立大鼠亚急性衰老模型后,予高、低浓度金花茶灌胃干预。测肝脏和睾丸组织超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)含量及bax、bcl-2 mRNA表达水平。结果与衰老模型组对比,高、低浓度金花茶组肝脏和睾丸组织SOD含量和bcl-2 mRNA表达显著升高(P<0.05),且MDA含量和bax mRNA表达明显下降(P<0.05)。高、低浓度金花茶组间比较,上述指标有统计学差异(P<0.05)。结结论金花茶可以提高SOD含量和降低MDA含量,通过上调bcl-2和下调bax表达水平,减慢肝脏和睾丸细胞的凋亡,对延缓机体衰老有重要作用。

沙格列汀联合预混胰岛素治疗2型糖尿病的效果及其对血糖波动的影响

目的:探讨沙格列汀联合预混胰岛素治疗2型糖尿病的效果及其对血糖波动的影响。方法:选取2017年5月至2018年3月广西医科大学第一附属医院老年内分泌科收治的100例2型糖尿病患者,按随机数字表法分为观察组和对照组,每组50例,其中对照组给予门冬胰岛素30注射液治疗,观察组给予沙格列汀联合门冬胰岛素30注射液治疗。检测两组患者治疗前、后空腹血糖(FBG)、餐后2h血糖(2hPG)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹胰岛素(Fins)、空腹血清C肽(FCP)及餐后2hC肽(2hCP)水平,计算胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),并应用动态血糖监测系统监测24h平均血糖水平。结果:治疗后,观察组HbA1c、FBG、2hBG、LDL-C、HOMA-IR显著低于治疗前及对照组,2hCP显著高于治疗前及对照组(均P<0.05)。治疗后,观察组TG水平显著低于治疗前,HDL-C、FCP、HOMA-β水平显著高于治疗前(P<0.05),但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组午餐前1h、晚餐前1h、早餐后3h、午餐后3h、晚餐后3h平均血糖水平、日内血糖平均波动幅度及日间血糖平均绝对差均显著低于对照组(均P<0.05)。结论:沙格列汀联合预混胰岛素对2型糖尿病患者的血糖控制效果更佳,并能降低血糖波动。

原代神经小胶质细胞培养方法的初探

目的:建立一种简单有效的小胶质细胞原代培养和纯化方法。方法:取出生24h的SD大鼠的脑皮层组织,胰酶消化成单个细胞、培养,待细胞长满培养瓶后,用力拍打培养瓶3min,离心并收集沉淀,加入新培养基再培养,采用免疫荧光法鉴定其纯度。结果:共聚焦显微镜鉴定小胶质细胞纯度达到96.85%。结论:拍击法提纯小胶质细胞的培养方法产量多,纯度高,为小胶质细胞在神经退行性疾病相关研究提供了基础。

激光拉曼光谱系统无损鉴别大鼠原代胰岛α、β细胞

目的:利用激光拉曼光谱系统无损区分贴壁生长的大鼠原代胰岛α、β细胞,并比较该方法与传统方法的优劣。方法:收集贴壁生长于定位格子培养皿中大鼠胰岛细胞的拉曼光谱、坐标及照片后应用免疫组化结合培养皿坐标定位确定胰岛细胞的分类,用主成分分析结合线性判别分析(PCA-LDA)对两种胰岛细胞拉曼光谱进行分析,用线性判别分析法对两种细胞大小进行分析,两组间光谱及面积差异则采用两独立样本t检验。结果:贴壁生长的胰岛β细胞体积较α细胞大,差异具有统计学意义(P=0.001);然而单纯利用面积胰岛α细胞及胰岛β细胞正确区分率分别为84.5%、50.0%;胰岛α细胞与胰岛β细胞的拉曼光谱有共同特征峰同时也存在显著差异的波峰,即二者有不同的"细胞分子指纹",且将该特点结合PCA-LDA的方法对胰岛α、β细胞进行区分正确率均为100%。结论:激光拉曼光谱系统可以成为快速无损区分胰岛α、β细胞的有效方法。

利拉鲁肽和有氧运动对肥胖大鼠下丘脑弓状核神经元凋亡的影响（英文）

目的:探讨利拉鲁肽和有氧运动对肥胖大鼠下丘脑弓状核(ARC)神经元形态学及细胞凋亡的影响。方法:高脂饮食建立肥胖大鼠模型,并随机分为高脂饮食+生理盐水组(HS组)、高脂饮食+利拉鲁肽组(HL组)、高脂饮食+有氧运动组(HE组);基础饲料喂养作为对照组(NC组)。HL组予皮下注射利拉鲁肽200μg/(kg·d),NC组和HS组均予皮下注射等量生理盐水,HE组进行无负重游泳训练,60 min/d。干预6周后,采用尼式染色观察下丘脑ARC神经元形态结构,免疫荧光染色法检测Bax、Bcl-2表达水平,TUNEL法检测神经细胞凋亡率。结果:尼式染色结果显示,NC组下丘脑弓状核区神经元结构完整,排列紧密;HS组下丘脑ARC神经元显著减少,排列紊乱,可见核固缩等明显改变;HL组和HE组神经细胞均有改善。与NC组相比,HS组细胞凋亡率和Bax表达显著增高,Bcl-2表达显著降低(均P<0.01)。利拉鲁肽或有氧运动可降低TUNEL阳性细胞数和Bax表达,同时上调Bcl-2表达(均P<0.01),且HL组改善效果更明显。结论:利拉鲁肽可明显改善下丘脑ARC神经元形态结构,抑制肥胖大鼠神经元凋亡,且效果优于有氧运动。

绝经前系统性红斑狼疮合并骨质疏松症患者血清中RANKL表达水平及临床意义

目的探讨绝经前系统性红斑狼疮(SLE)合并骨质疏松症(OP)患者血清中的RANKL表达水平及临床意义。方法纳入确诊SLE且合并OP的绝经前女性患者26例为OP组,选取无OP的绝经前SLE患者26例为N-OP组,另26例非绝经期女性健康体检者为健康对照组,并以ELISA法测定研究对象血清中RANKL水平。结果 SLE组RANKL水平高于健康对照组,合并OP组与未合并OP组RANKL水平均高于健康对照组(P<0.05),且合并OP组RANKL水平高于未合并OP组(P<0.05)。结论绝经前SLE合并OP患者常伴有血清RANKL水平升高,高RANKL水平可能为绝经前SLE患者OP发生的独立危险因素。

高葡萄糖诱导的胰岛β细胞NIT-1细胞凋亡的拉曼光谱变化

目的探讨拉曼光谱在高葡萄糖诱导胰岛β细胞NIT-1细胞凋亡的变化,为研究细胞凋亡探索新路径。方法按不同葡萄糖浓度及不同培养时间将NIT-1胰岛β细胞分成6组。AnnexinV/PI染色流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率及激光光镊拉曼光谱仪检测细胞拉曼光谱,比较各组凋亡率及分析光谱信息。结果高糖培养组细胞凋亡率较对照组高,并且随着培养时间的延长高糖培养组的凋亡率逐渐增加(P<0.05),培养4 d后漂浮在培养基中的细胞大多数处于晚期凋亡状态。随着高糖培养时间的延长,拉曼光谱中代表蛋白质含量的1 001/cm峰峰面积及代表核苷酸含量的1 337/cm峰峰面积逐渐降低(P<0.05)。结论高糖可以诱导NIT-1细胞凋亡,且凋亡率随诱导时间的延长而增加。拉曼光谱可以反映凋亡细胞内蛋白质与核苷酸含量的降低。

波动性高糖对INS-1细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

目的探讨波动性高糖对INS-1细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响及其分子机制。方法将INS-1细胞随机分为三组。正常对照组(NG):含5.5 mmol/L葡萄糖;持续高糖组(SHG):含33.3 mmol/L葡萄糖;波动性高糖组(IHG):含5.5 mmol/L或33.3 mmol/L葡萄糖,每24 h交替换液1次,均培养3 d。3 d后检测各组INS-1细胞活性及凋亡百分率,胰岛素分泌量,Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(CytC)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平以及胰岛素(insulin)和胰岛十二指肠同源盒-1(PDX-1)mRNA表达水平。结果与NG组相比,SHG组与IHG组凋亡率均明显升高,细胞活性明显降低,Bax、CytC及Caspase-3表达明显增强,胰岛素分泌量及insulin、PDX-1 mRNA表达水平均明显降低(P均<0.01);与SHG组相比,IHG组细胞活性及胰岛素分泌量明显降低,凋亡率及Caspase-3明显增加(P均<0.01),Bax、CytC表达水平与insulin及PDX-1 mRNA表达水平均未见统计学差异。结论波动性高糖能导致胰岛细胞凋亡增加和功能障碍,其机制可能与上调Bax、CytC、Caspase-3及降低insulin与PDX-1基因表达等相关。

高糖高脂环境下生长激素释放肽对胰腺β细胞自噬的影响（英文）

目的:探讨高糖高脂(HGHL)环境下生长激素释放肽(ghrelin)对胰腺β细胞自噬的影响。方法:将胰岛NIT-1细胞分为对照组(葡萄糖5.6mmol/L)、ghrelin组(葡萄糖5.6mmol/L+100nmol/L ghrelin)、HGHL组(葡萄糖33.3mmol/L+0.5mol/L棕榈酸)、HGHL+ghrelin组(葡萄糖33.3mmol/L+0.5mol/L棕榈酸+100nmol/L ghrelin)。采用CCK-8法检测NIT-1细胞活性。采用单丹磺酰戊二胺(MDC)染色和微管相关蛋白1轻链3(LC3)B免疫荧光染色检测细胞自噬活性。结果:HGHL+ghrelin组细胞活力、Beclin 1蛋白水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、Atg6和LC3B基因相对表达量均显著高于HGHL组(均P<0.05)。MDC染色和免疫荧光染色显示,HGHL+ghrelin组细胞内自噬泡数量和阳性LC3B斑点数目增加。结论:Ghrelin能保护胰岛β细胞免受HGHL损伤,可能与自噬能力的增强有关。

胰高血糖素样肽-1对不同浓度葡萄糖刺激下NIT-1细胞胰岛素原合成的短期影响

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)在高、低浓度葡萄糖作用下对胰岛β细胞胰岛素原合成的短期影响及随时间的变化趋势。方法:将NIT-1细胞随机分为以下4组:LG组(培养液中含5.6 mmol/L的葡萄糖)、LGG组(培养液中含5.6 mmol/L的葡萄糖和20 nmol/L的GLP-1)、HG组(培养液中含16.7 mmol/L的葡萄糖)、HGG组(培养液中含16.7 mmol/L的葡萄糖和20 nmol/L的GLP-1)。检测基线0 h及葡萄糖和(或)GLP-1刺激后2、4、6、8、10 h各组胰岛β细胞胰岛素原mRNA和蛋白表达。结果:基线时各组胰岛素原表达无统计学差异(P>0.05),刺激2、4、6、8、10 h后HG组、HGG组胰岛素原表达均显著增高(P<0.05),而LG和LGG组无明显变化(P>0.05)。组间比较HGG组胰岛素原表达量显著高于LG组、LGG组及HG组(均P<0.05)。HG组胰岛素原表达量显著高于LG组、LGG组(均P<0.05)。胰岛素原mRNA的相对表达量在刺激后4 h达到高峰,而胰岛素原蛋白的表达量在2 h达到高峰。结论:在高糖条件下,GLP-1短期刺激胰岛β细胞可显著增加胰岛素原合成,GLP-1联合高糖对胰岛素原合成具有协同作用。胰岛β细胞在受到高糖或高糖+GLP-1刺激后胰岛素原蛋白表达的高峰要先于胰岛素原mRNA表达的高峰。

基于TLR4信号通路研究利拉鲁肽对脂多糖诱导的原代小胶质细胞炎症反应的作用机制

目的:基于Toll样受体4(TLR4)信号通路,探索利拉鲁肽抑制脂多糖(LPS)诱导的原代小胶质细胞炎症反应的机制。方法:选取出生1 d SPF级SD大鼠,分离培养原代小胶质细胞,利用免疫荧光染色特异性蛋白Iba-1检测其纯度,将细胞随机分为5组:空白对照(N)组、脂多糖(LPS)组、利拉鲁肽(Li)组、脂多糖+利拉鲁肽(LL)组及脂多糖+TLR4抑制剂(LT)组。LPS组用LPS干预24 h,Li组用利拉鲁肽干预24 h,LL组用LPS干预24 h+利拉鲁肽干预24 h,LT组用LPS干预24 h+TAK-242干预24 h。用流式细胞仪测定各组细胞总凋亡率,以蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6蛋白在各组中的表达情况。结果:与N组比较,LPS组细胞总凋亡率上升(P<0.05);与LPS组比较,LL组和LT组细胞的总凋亡率呈下降趋势(P<0.05)。与N组比较,LPS组IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6蛋白相对表达量增高(P<0.05);与LPS组比较,LL组和LT组IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达呈下降趋势(P<0.05)。结论:利拉鲁肽可能通过下调TLR4信号通路中关键因子表达抑制LPS诱导的原代小胶质细胞炎症反应,并改善细胞凋亡,保护神经系统。

大鼠体重调定点测量方法初探

目的:以储食法测量大鼠体重调定点,并探讨饮食量限制对体重调定点的影响。方法:选取雄性SD大鼠12只,随机分为对照组和实验组,每组6只。测量基线体重调定点后,对照组保持测量基线调定点饮食量,实验组给予饮食量限制(正常饮食量的70%),观察6周,之后两组均予以测量基线调定点饮食量继续观察6周。测量各时间点大鼠储食量及体重,通过线性回归法计算大鼠体重调定点。结果:大鼠体重和体重调定点随鼠龄增长而增加。限制饮食量不能降低大鼠体重调定点(P>0.05)。饮食量限制期间,大鼠体重明显下降(P<0.01),撤除饮食量限制后,大鼠体重出现反跳现象(P<0.01)。结论:饮食量限制可短期降低大鼠体重,但不能降低实验动物体重调定点,其短期体重反弹风险较高。利用储食法测量大鼠体重调定点方法稳定而可靠。

线粒体糖尿病一例

1临床资料患者,女,15岁,因“口渴多饮、双下肢乏力6月余”于2019年7月首次入院。2019年1月出现口渴多饮、双下肢乏力伴消瘦,诊断为“糖尿病”,曾尝试使用磺脲类药物降糖,血糖控制欠佳,后期改胰岛素降糖,2019年6月自行停用胰岛素,逐渐出现头部双颞侧放电样痛。既往有慢性胃炎病史。家族史:母亲否认糖尿病史,奶奶有糖尿病史,父亲智能低下,因“脑卒中”已去世。

短期胰岛素刺激对HIT-T15细胞胰岛素原基因表达的影响

目的探讨短期外源性胰岛素刺激对HIT-T15胰岛β细胞胰岛素原(PI)基因表达的影响及机制。方法HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞随机分为4组:含1.4 mmol/L葡萄糖完全培养基组作为空白对照(LG组),为抑制内源性胰岛素释放干扰以低糖联合硝苯地平作为条件对照(LGC组),在LGC基础上分别加0.5 U/L或5 U/L的外源性胰岛素作为实验组(分别为LINS组和HINS组),分别在刺激后0、30、60、90、120 min以荧光定量PCR检测各组PI mRNA,免疫组化检测各组细胞胰岛素受体底物1(IRS1)酪氨酸磷酸化水平。结果 (1)LINS组、HINS组细胞PI mRNA表达均上调,在刺激后60 min PI mRNA表达量达高峰。(2)实验组在刺激后30 min IRS1酪氨酸磷酸化水平较对照组明显增高,高、低浓度胰岛素组细胞酪氨酸磷酸化达高峰时间不同。(3)LG组和LGC组间PI mRNA表达及IRS1酪氨酸磷酸化水平无明显差异。结论短期外源性胰岛素能上调胰岛β细胞PI基因的表达,且高浓度的胰岛素较低浓度胰岛素作用强。PI表达调控与IRS1信号传导有关。

胰高血糖素样肽-1对葡萄糖刺激下胰岛β细胞胰岛素原合成的短期作用

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)在高浓度、低浓度葡萄糖作用下对胰岛β细胞胰岛素原合成的短期影响。方法:将NIT-1细胞随机分为低浓度葡萄糖(LG)组、低浓度葡萄糖+GLP-1(LGG)组、高浓度葡萄糖(HG)组和高浓度葡萄糖+GLP-1(HGG)组4组。检测基线0h及葡萄糖和(或)GLP-1刺激后4h各组细胞胰岛素原基因和蛋白表达。结果:基线时各组胰岛素原表达无显著差异(P>0.05),4h后HG组、HGG组胰岛素原表达均明显增高(P<0.05),而LG和LGG组无明显变化(P>0.05)。组间比较,HGG组胰岛素原表达量明显高于LG组、LGG组及HG组(均P<0.05)。HG组胰岛素原表达量显著高于LG组、LGG组(均P<0.05)。结论:在高浓度葡萄糖条件下,短期GLP-1刺激可显著增加胰岛β细胞胰岛素原合成;GLP-1联合高糖对胰岛素原合成具有协同作用。

原代大鼠胰岛细胞分离纯化及单细胞培养初探

目的:探讨获得高质量、数量多的原代大鼠胰岛细胞的有效可靠的方法。方法:以Ⅴ型胶原酶顺行灌注大鼠胆总管消化胰腺,以Histopaque 1077等密度区带离心法分离胰岛和胰腺腺泡组织。以双硫腙染色及免疫组化法分别鉴定提取物,胰岛素释放试验鉴定胰岛的活性。结果:经Histopaque 1077等密度区带离心法分离纯化,每只大鼠平均获取(251±26)枚胰岛。双硫腙染色后完整胰岛呈猩红色细胞团。胰岛单细胞培养及胰岛素释放试验起始2.8 mmol/L低糖培养胰岛素分泌量为(23.53±5.946)pmol/L,16.7mmol/L高糖刺激后胰岛素分泌量为(32.61±4.085)pmol/L,最后恢复2.8mmol/L低糖培养胰岛素分泌量为(27.81±3.616)pmol/L,3者之间比较差异均有统计学意义(P<0.05),提示胰岛细胞活性良好。结论:用Histopaque 1077等密度区带离心法分离纯化原代大鼠胰岛细胞兼具有数量多、活性好、纯度高的优点,可继续用于研究。

脂多糖干预时间与小胶质细胞iNOS表达时效关系的研究

目的:探索脂多糖(LPS)干预原代小胶质细胞时间与表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)时效关系的研究,为小胶质细胞建立炎症模型提供依据。方法:把提纯后的原代小胶质细胞随机分为实验组和对照组。实验组分别用LPS干预6 h、12 h、24 h和48 h,对照组为LPS未干预组,即LPS干预0 h。用免疫荧光和蛋白质免疫印迹法(Western blot)分别检测iNOS在小胶质细胞中的表达。结果:实验组LPS干预小胶质细胞6 h、12 h、24 h和48 h后iNOS的表达量增高,其中12 h,24 h,48 h与对照组0 h比较,差异有统计学意义(P<0.01),且在24 h前逐渐升高,24 h达峰值,24 h后逐渐下降。结论:iNOS表达量与LPS干预原代小胶质细胞的时间有关,LPS干预24 h时iNOS表达最高,LPS干预24 h为理想的小胶质细胞炎症模型。