猪链球菌靶向DC重组蛋白DC3pep-SDZ对斑马鱼的免疫保护性分析

为了探究本课题组前期构建的由猪链球菌(SS)的分泌型DNA核酸酶A(SsnA)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH)和高亲和力锌摄取系统蛋白(ZnuA)3个毒力因子的优势细胞表位和树突状细胞靶向肽(DC3pep)串联而成的重组蛋白DC3pep-SDZ(SsnA-DLDH-ZnuA)对致病型SS攻击斑马鱼的免疫保护效果,本试验表达和纯化重组蛋白DC3pep-SDZ和SDZ,分别免疫AB系野生型斑马鱼,攻击致病型2、3和9型SS(SS2、SS3和SS9),计算存活率,采用苏木精-伊红(H.E.)染色法观察斑马鱼脑组织病理变化,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析SS3感染斑马鱼后脑组织炎性细胞因子表达量变化。结果显示,诱导表达的重组蛋白DC3pep-SDZ和SDZ分子质量分别为44和42 kDa,2个蛋白均以可溶的形式表达。SS2、SS3和SS9攻击斑马鱼后,重组蛋白DC3pep-SDZ组和重组蛋白SDZ组斑马鱼存活率分别为50.0%、65.0%和60.0%,45.0%、47.3%和45.0%,两组间差异不显著(P>0.05),但与PBS对照组相比差异均极其显著(P<0.001)。H.E.染色镜检结果显示,重组蛋白DC3pep-SDZ组的斑马鱼被3种分型SS攻击后脑组织均无明显病理变化。RT-qPCR结果显示,重组蛋白DC3pep-SDZ组促炎细胞因子:与PBS对照组相比较IL-6、TNF-α和IFN-γmRNA表达量分别极显著(P<0.01)、极其显著(P<0.001)和极显著(P<0.01)下调,与重组蛋白SDZ组相比较IL-6和TNF-αmRNA表达量分别极显著(P<0.01)和显著下调(P<0.05);重组蛋白DC3pep-SDZ组抗炎性细胞因子:与PBS对照组相比较IL-10和TGF-β1 mRNA表达量分别极显著(P<0.01)和极其显著(P<0.001)上调,与重组蛋白SDZ组相比较TGF-β1 mRNA表达量显著上调(P<0.05)。结果表明,重组蛋白DC3pep-SDZ较SDZ具有更好的免疫原性,能产生SS2、SS3和SS9交叉免疫保护作用,同时还能够有效缓解斑马鱼感染SS3后的脑部炎症。

裂解性噬菌体内溶酶和穿孔素抗革兰阴性菌的研究进展

随着细菌耐药情况的日益严重,人们开始寻找抗生素的代替物,噬菌体内溶酶(endolysin)和穿孔素(holin)受到了关注。其中内溶酶展现了良好的抑菌潜力,与抗生素和噬菌体制剂相比有着一定的优点。而内溶酶的作用特点决定了其在抑制革兰阴性菌时需要穿孔素的协同,因此有研究利用基因工程把内溶酶和穿孔素进行重组来解决这一问题。此外,在噬菌体-细菌相互作用的研究中,已有研究表明噬菌体基因参与调控细菌间的通讯系统,内溶酶和穿孔素正是其中重要的调控因素。本文通过对噬菌体与噬菌体制剂的研究进展、内溶酶和穿孔素抗革兰阴性菌的研究进展及其应用进行了综述,以期为未来有关噬菌体裂解酶的研究提供思路。

猪链球菌3种毒力因子多细胞表位靶向DC重组蛋白DC3pep-SDZ的构建及安全性检测

为了研制2、3、9型猪链球菌(SS)通用的重组亚单位疫苗,本研究通过生物信息学软件对SS分泌型核酸酶A(SsnA)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH)、锌转运蛋白(ZnuA)3种毒力因子的蛋白质一级结构、B细胞及辅助T(Th)细胞抗原表位、亲疏水性及抗原性、二级结构进行综合分析后,预测获得了SsnA、DLDH和ZnuA具有亲水性和较好抗原性的B/Th细胞表位,将它们与12聚体树突状细胞靶向肽(DC3pep)序列串联后获得了重组氨基酸序列DC3pep-SDZ。经蛋白质理化分析DC3pep-SDZ分子质量约为44 ku,理论等电点(pI)为4.65,平均亲水性为-0.462,为亲水性蛋白。由生物公司构建重组原核表达载体pET28a-DC3pepSDZ,转化感受态细胞后经IPTG诱导表达后经western blot鉴定重组蛋白以可溶形式表达。表达产物利用亲和层析镍柱纯化,SDS-PAGE结果显示得到44 ku的纯化目的蛋白,纯化浓缩后经BCA蛋白浓度测定试剂盒检测,浓度为5.60 mg/mL。利用不同浓度纯化重组蛋白对2%猪红细胞悬液进行体外溶血试验,并对PK15、IPEC-J2细胞进行毒性试验,检测重组蛋白的生物安全性。体外溶血试验结果显示在5μg/mL~500μg/mL浓度范围内,DC3pep-SDZ蛋白对2%猪红细胞悬液溶血率低于5%;细胞毒性试验结果显示经500μg/mL DC3pep-SDZ蛋白孵育后,PK15与IPEC-J2细胞的相对增殖率(RGR)分别为98.5%和99.6%,与对照组RGR相比均无显著差异。表明,重组蛋白无明显毒性作用。本实验首次构建并表达了重组蛋白DC3pep-SDZ,该蛋白生物安全性良好,为后续分析其免疫保护效果、研发2、3、9型SS重组亚单位疫苗奠定基础。

控制高压油管压力对提高燃油发动机工作效率的研究

通过对柱塞腔凸轮的角速度进行控制,实现了高压油管内部压力保持不变,进而解决了高压燃油机工作效率不高的问题。该方法对解决类似问题有一定指导意义。

不同毒力副猪嗜血杆菌生物被膜形成能力及特性

为探索不同毒力(血清型)副猪嗜血杆菌(HPS)生物被膜形成能力与胞外多糖含量、细胞黏附性和耐药情况的相关性,本试验经细菌分离鉴定后,通过PCR鉴定HPS血清型和被膜基因数量,K-B纸片扩散法检测耐药性,结晶紫半定量法检测生物被膜形成能力及动态形成过程,苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量,宿主细胞黏附试验判定侵袭力。结果显示:中等毒力菌株(HPS-4)主要对四环素类、β-内酰胺类、林可胺类耐药;无毒型菌株(HPS-7)和未分型菌株(HPS-NT)仅分别对林可胺类、四环素类耐药;强毒株(HPS-5)对常见抗菌药均敏感。在生物被膜形成过程中,强毒株(HPS-5)生物被膜形成能力最强,未分型菌株(HPS-NT)最弱;各血清型HPS在培养36 h后生物被膜含量开始明显增多,第60小时和第72小时相比,被膜增加量形成差异极显著(P<0.01),在72 h时生物被膜形成量达到峰值,随后减少。中等毒力菌株(HPS-4)胞外多糖含量最高,强毒株(HPS-5)最少,但差异不显著(P>0.05)。被膜基因检测结果显示,中等毒力菌株(HPS-4)被膜基因CRP、LpxM呈阳性;强毒株(HPS-5)被膜基因LpxM、LuxS、qseC呈阳性;无毒型菌株(HPS-7)被膜基因LpxM呈阳性;未分型菌株(HPS-NT)被膜基因LpxM、CRP呈阳性。中等毒力菌株(HPS-4)对PK-15的黏附率为26.3%;强毒株(HPS-5)为30.0%;无毒型菌株(HPS-7)为23.6%;未分型菌株(HPS-NT)为22.0%,四者差异不显著(P>0.05)。结果表明,强毒株(HPS-5)生物被膜形成能力和对宿主细胞黏附性更强,各血清型HPS在培养72 h时生物被膜形成量最大,达到成熟阶段,各血清型HPS耐药情况不一,可能与地区和猪场用药情况不同相关。

多元摩拉菌分离株生物被膜形成能力及其致病和耐药情况研究

为了研究分离的猪多元摩拉菌生物被膜形成能力及相关特性,了解其致病性和耐药情况,试验采集天津市某猪场因患猪繁殖与呼吸道综合征并继发细菌感染而导致死亡的猪的心脏、肺脏进行细菌分离培养、生化试验、16S rDNA基因序列测定,并对分离菌进行药敏试验、生物被膜及相关基因检测、PK-15细胞黏附试验、致病力研究及毒力基因检测。结果表明:分离菌为革兰氏阴性球菌且多成对排列;氧化酶试验呈阳性,不分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、蕈糖、木糖,PCR产物大小为868 bp,结合16S rDNA测序结果经BLAST比对鉴定为摩拉菌属成员,与多元摩拉菌(M.pluranimalium)序列的同源性达99.71%,将分离菌命名为M.pluranimalium 1120;M.pluranimalium 1120对氟苯尼考、林可霉素、阿莫西林、恩诺沙星、左氧氟沙星耐药,对头孢噻肟中度敏感,对头孢曲松敏感;在培养至第60小时时生物被膜形成量达到峰值,并检测到生物被膜基因LuxS、LpxM、CRP、nanH、SiaB;对PK-15细胞的平均黏附率为13.3%,黏附能力较弱;对小鼠致病性弱,腹腔注射1×10^(11)cfu/mL菌液0.1 mL的小鼠仅表现饮食欲减退且感染2 d后情况好转,剖检可见肺脏水肿、充血,肝脏、脾脏、肾脏、胃、十二指肠和肠黏膜不同程度淤血、水肿;未检测到毒力基因UspAI。说明M.pluranimalium 1120对多种常见抗生素耐药,生物被膜形成能力强,对PK-15细胞的黏附能力弱,对小鼠致病性低。