应用荧光定量RT-PCR方法检测PRRSV变异株在仔猪体内动态分布

为进一步了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(HuN4株)在体内的动态分布规律和特点,探讨病毒对组织器官的嗜性,本研究将HuN4株和细胞传代致弱毒株HuN4-F65人工感染40日龄健康仔猪,分别于感染后1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d和28d各迫杀2头,并应用建立的荧光定量RT-PCR方法对脑、颌下淋巴结、扁桃体、肺脏、肝脏和十二指肠等组织及血清中的PRRSV进行定量检测。结果显示:感染后HuN4组各器官病毒载量比HuN4-F65组高100倍,病毒载量峰值期出现在感染后7d,随后呈下降趋势。HuN4株在仔猪体内分布广泛,在21d的试验期内持续存在,并且各器官的病毒载量呈正态分布规律;而HuN4-F65株血清病毒载量较低,并且集中在单核巨噬细胞相对密集的扁桃体和颌下淋巴结,与HuN4株主要嗜性器官肺脏相比发生了改变。

PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗免疫特性的研究

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株疫苗的免疫机理和明确PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗各自的免疫特性,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫PRRSV抗原和抗体阴性的健康断奶仔猪,免疫后21d用PRRSV变异株HuN4强毒攻毒,ELISA方法检测血清中PRRSV特异的抗体水平及TNF-α、IFN-α、IL-1、IL-6和CRP细胞因子水平,荧光定量RT-PCR方法检测病毒血症的发生和持续情况,并取主要器官进行病理组织学观察。结果表明:HuN4活疫苗组免疫后14d便可检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d各细胞因子水平升高,攻毒后21d病毒血症完全消失,免疫后各器官没有明显病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化轻微;JXA1株灭活苗组免疫期间没有检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d～9d各细胞因子水平升高,攻毒后病毒血症持续存在,免疫后各器官有轻微病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化比HuN4活疫苗组严重,但比对照组明显减轻。本实验表明,HuN4活疫苗能够快速有效的激发机体的体液免疫反应,在抵抗PRRSV变异株HuN4强毒攻毒时,临床症状明显优于JXA1灭活苗。

猪链球菌WC-SS7株GDH基因的表达及GDH蛋白单克隆抗体的制备

目的原核表达猪链球菌7型临床分离株WC-SS7的GDH蛋白,制备抗GDH蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法将临床分离的猪链球菌7型WC-SS7株的GDH基因克隆入表达载体pET-30a,转入大肠杆菌中,用IPTG诱导表达,用Ni化琼脂糖柱(Pierce)纯化的GDH蛋白免疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA方法筛选阳性克隆,对抗WC-SS7GDH蛋白单克隆抗体进行特异性鉴定及亚型鉴定。结果表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析后,在约为52KD处可见一条明显的诱导表达带,说明GDH蛋白得到了正确的表达;细胞融合后检测为阳性的细胞株经过3次单克隆筛选,最终得到了6株能和GDH蛋白反应的能稳定分泌单抗的阳性细胞克隆,这些单抗通过Western鉴定结果显示其具有良好的特异性,6株单克隆抗体亚型鉴定结果显示其亚型均为IgG1型,且轻链均为κ链。结论本研究成功表达了WC-SS7的GDH蛋白,并获得了6株能和GDH蛋白反应的、能稳定分泌单抗的阳性细胞克隆,所获得的重组GDH蛋白及特异性单克隆抗体能用于猪链球菌结构和功能的研究,为猪链球菌临床感染血清学诊断方法的建立奠定基础。

高致病性PRRS VORF3基因在昆虫细胞中的表达与免疫原性研究

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3的结构、功能和免疫学特性,本研究根据GenBank登录的高致病性PRRSV变异株(HP-PRRSV) HuN4株ORF3基因序列,经序列分析去除其N端的一部分疏水性区域(1aa～49aa),设计合成引物。将扩增的基因连接于pFastBac HTb杆状病毒载体中,构建重组质粒pF-ORF3,转化至感受态DH10Bac中,获得重组杆粒rBac-ORF3。再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rAc-ORF3。用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)分析表明GP3在昆虫细胞Sf9中获得正确表达,而且具有良好的反应活性。用纯化的GP3免疫小鼠,制备抗GP3多克隆抗血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其效价。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达了重组GP3,经GP3免疫的小鼠体内产生了较高滴度的特异性抗体,证明表达的GP3具有特异的免疫原性。

高致病性PRRSV HuN4株Nsp4的原核表达及其抗体水平检测

为进一步研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Nsp4的免疫学特性,本研究根据PRRSV HuN4株序列,设计并合成用于扩增PRRSV HuN4株Nsp4基因的引物。将扩增产物与原核表达载体pGEX-6P-1连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。Western blot试验显示,Nsp4在大肠杆菌中获得较高水平的表达,并且具有良好的反应活性。利用该蛋白建立ELISA方法,检测PRRSV HuN4株感染仔猪的不同时间内的血清,并比较抗Nsp4,囊膜蛋白和M蛋白,N蛋白的抗体水平,结果表明Nsp4抗体升高的时间晚于囊膜蛋白和M蛋白、N蛋白出现的时间,同时抗体水平也低于其他蛋白。

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp7的免疫原性,本研究将PRRSV Nsp7进行了原核表达。SDS-PAGE和western blot试验表明,Nsp7在大肠杆菌中获得大量表达,并且其具有较好的反应活性。采用Nsp7免疫小鼠制备多克隆抗体,并进行间接ELISA检测,表明多克隆抗体效价达到1∶32 000以上;间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别PRRSV的Nsp7,显示出Nsp7具有较好的免疫原性。本研究获得了高纯度可溶性的PRRSV Nsp7,并进一步制备多克隆抗体,为研究Nsp7蛋白的免疫学特性提供实验依据。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因的原核表达

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的结构、功能及免疫学特性,根据GenBank中已发表的高致病性PRRSV HuN4株ORF3基因序列,设计合成扩增PRRSV ORF3基因的引物。将扩增的基因克隆到表达载体pProEx HTb中,转化到大肠埃希菌BL21进行表达。Western blot分析表明,GP3蛋白在大肠埃希菌中获得正确表达,且具有良好的反应活性。将纯化的GP3蛋白免疫小鼠制备抗GP3多克隆血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其效价,结果在小鼠体内产生较高滴度的特异性抗体,证明PRRSV GP3蛋白具有良好的抗原性。

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7间接ELISA检测方法的建立

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的检测方法,本研究以重组Nsp7作为包被抗原,通过优化反应条件,建立PRRSV抗体间接ELISA检测方法。该检测方法与猪瘟等常见的6种猪病毒病的阳性血清无交叉反应,显示出良好的特异性。其检测标准血清的最低稀释倍数为1∶3 200,显示出良好的敏感性。批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%,显示出良好的重复性。采用该检测方法检测400份临床血清样品,实验结果表明该方法与商品化的IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒符合率达到95.0%～96.8%;与LSI PRRSV抗体检测试剂盒符合率达到94.0%～96.5%。

荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV疫苗免疫仔猪攻毒前后抗原在体内的动态分布

为了更好地了解高致病性PRRSV疫苗的免疫机理,试验应用荧光定量RT-PCR方法比较了PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫仔猪攻毒前后PRRSV在体内动态分布的差异。结果表明:HuN4活疫苗组攻毒后,病毒在各组织中的含量明显低于JXA1灭活苗组和对照组;JXA1灭活苗组攻毒后,病毒在各组织中的分布、载量与对照组相似,但较对照组轻。说明HuN4活疫苗免疫仔猪攻毒后,能明显抑制病毒在各组织中的复制,其免疫效果明显优于JXA1灭活苗。

当前主要羊病的流行及防治

养羊业机遇与挑战：与当前全国猪类和禽类的市场波动相比，羊肉的价格持续稳定在比较高的价格；同时，随着规模化饲养、种羊、育肥羊在全国范围的流动，导致疫病流行范围不断扩大，种类不断增加，给养殖增加了很大难度。规模化养羊是以后养殖发展的趋势，但势必会带来一些问题。

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定及ORF5基因的序列分析

通过常规病毒检测和分离方法,从东北某猪场送检的猪肺部组织样品中检测分离猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),经过电镜观察和间接免疫荧光检测,并根据PRRSV美洲标准株VR-2332的ORF5基因设计特异引物,利用RT-PCR扩增并克隆ORF5基因,分析其与国内外PRRSV毒株间的同源性。结果表明,所分离株是PRRSV,命名为Jsp-1。

非洲猪瘟时代对生物安全和疫病防控的反思

2018年非洲猪瘟在我国发生,给我国养猪业带来严重的经济损失。同时由于我国生猪养殖量庞大,养殖范围分布广泛,生物安全体系建立不够完善,使得我国在预防和控制非洲猪瘟上倍感压力。该病毒本身的特性决定了在疫苗研制和生物安全防控的实施上都会存在一定的难度,因此应该做好与非洲猪瘟做长期斗争的准备。文章主要探讨国外预防非洲猪瘟的生物安全实施经验和我国在发生非洲猪瘟之后在各方面采取的积极应对措施。

镉对雌性动物生殖系统的影响

镉（Cd）是一种公认的对动物健康有害的金属元素。研究表明，镉中毒可引起家畜及人发生呼吸机能不全、运动失调、贫血、心血管疾病、骨质疏松、免疫力低下及癌症等多种疾病，甚至会出现急性中毒死亡，并且还具有明显的生殖内分泌干扰作用。镉作为高度可疑的具有雌激素样作用的物质已越来越受到人们的关注。工业和日常生活活动造成镉对自然界的污染有日渐严重的趋势。

黑龙江省羊布鲁氏菌病风险因素分析

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患的传染病,给畜牧业造成巨大经济损失,同时也对人体健康构成严重威胁。2006—2008年,本研究应用血清学方法对黑龙江省羊布鲁氏菌病进行了流行病学调查,结果在13个市(地区)均检出布病阳性羊,血清学阳性率在0.90‰～4.94‰,平均阳性率为3.32‰。通过应用流行病学、统计学方法对羊布鲁氏菌病风险因素进行了分析,初步确定了本地及毗邻地区疫情、养羊业生产状况、地理气候条件。

猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪动脉血管内皮细胞上的培养特性

探索应用原代猪血管内皮细胞培养猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究PRRSV对血管内皮细胞的损伤及其作用机制建立模型。用Ⅱ型胶原酶灌注60日龄健康仔猪颈总动脉分离获得动脉血管内皮细胞,以PRRSVHuN4株接种原代猪血管内皮细胞,进行细胞形态和荧光定量RT-PCR检测。结果显示,PRRSV接种原代猪血管内皮细胞后,呈现典型的细胞病变,病毒增殖规律与Marc-145细胞基本相同。结果表明,在猪血管内皮细胞上成功复制了PRRSV,为下一步研究PRRSV在血管内皮细胞中的复制及其导致的病理损伤提供了试验依据。

家畜布鲁氏菌病风险评估框架的研究

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病,黑龙江地区曾长期流行该病,特别是20世纪90年代末以来,布鲁氏菌病发病率出现持续的上升。建立家畜布鲁氏菌病风险评估方法。