中药灌肠1号对小鼠结肠炎CD4^＋CD25^＋免疫作用的研究

目的:探讨CD4^+CD25^+调节性T细胞(Tregs)在2,4-二硝基氯苯(DNCB)和醋酸(AA)复合法诱发的小鼠溃疡性结肠炎中的变化规律及中药灌肠1号治疗的作用机制。方法:建立DNCB+AA复合法诱发的小鼠溃疡性结肠炎模型,设立正常对照、模型对照、柳氮磺氨吡啶(SASP)和中药灌肠1号治疗共4组,用流式细胞仪检测各组外周血、肠系膜淋巴结CD4^+CD25^+Tregs细胞的变化以及结肠组织病理学改变。结果:建模后1～2周,模型组外周血和肠系膜淋巴结的CD4^+CD25^+Tregs细胞数量较正常组明显下降,而使用SASP和中药灌肠Ⅰ号治疗后该细胞亚群明显高于模型组。结论:具有较强免疫抑制作用的CD4^+CD25^+Tregs细胞亚群在小鼠实验性溃疡性结肠炎的发病及病情转归中可能具有重要免疫调节作用,中药灌肠1号通过调节Tregs细胞的数量对溃疡性结肠炎发挥治疗作用。

携带人肝细胞生长因子的重组裸质粒对放射复合皮肤创伤促愈作用的实验研究

目的应用携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的重组裸质粒(pUDKH)观察其对放射复合皮肤创伤伤口愈合的影响。方法清洁级雄性Wistar大鼠110只,按体重随机分为单纯创伤(单伤组)、创伤+伤口局部照射(伤照组)和创伤+伤口局部照射+pUDKH治疗(pUDKH组)3组。图像分析仪测量伤口愈合面积和肉芽组织内血管密度;病理学观察各组大鼠伤口愈合的动态变化。结果伤后第1～28天伤照组动物伤口面积差值持续小于单伤组(对照组),伤口愈合速度较慢;而pUDKH组于伤后第7～21天其面积差值明显大于伤照组(P<0.05),表明pUDKH基因能促进放射性复合伤伤口的愈合,其愈合速度较伤照组提前1周左右。病理学观察表明,照后早期伤照组渗出物较单伤组和pUDKH组减少,出血坏死较明显,中后期肉芽组织生机不良,新生毛细血管较单伤组和pUDKH组明显减少,晚期伤口愈合较慢,其愈合时间较单伤组和pUDKH组延迟1周左右。结论 HGF基因能明显促进放射复合创伤伤口的愈合,表现在促进伤口区肉芽组织的生长、肉芽组织内成纤维细胞增生和毛细血管的生成及促进表皮角质层的形成和重上皮化过程。pUDKH重组质粒组伤口愈合速度较伤照组提前1周左右。

重组胸腺素α1 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌的构建与表达

目的构建表达重组胸腺素α1(Tα1)的pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌。方法将人工合成的Tα1序列进行PCR扩增,将扩增的片段和pMAL-C2x质粒载体分别经BamHI和EcoR I双酶切后,用T4 DNA快速连接酶连接构建pMAL-C2x-Tα1融合表达质粒,再经测序正确后,将重组体转化至大肠埃希菌TB1菌中,pMAL-C2x-Tα1/TB1菌在LB液体培养基中培养,经IPTG诱导表达麦芽糖结合蛋白与Tα1的融合蛋白(MBP-Tα1),采用Westernblot对MBP-Tα1进行鉴定。结果 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌能有效表达MBP-Tα1,融合蛋白占菌体蛋白的33.6%,分子量约为45×103。结论工程菌的成功构建和表达为重组Tα1的纯化、生物学活性等研究奠定了基础。

复合法诱发小鼠结肠炎模型的建立和免疫学验证

目的:建立2,4-二硝基氯苯(DNCB)和醋酸(AA)复合法诱导的小鼠结肠炎模型,并验证其在炎性肠病(IBD)发病及治疗机制中的研究价值。方法:昆明种小鼠48只,按体重随机分为正常对照、模型、硫氮磺胺吡啶(SASP)及中药灌肠治疗4组,肠道积分法观察组织病理学变化;DAPI染色检测淋巴细胞凋亡指数的改变;流式细胞仪分析外周血中CD4^+CD29^+T细胞及外周血和肠系膜淋巴结中CD3^+、CD4^+ T细胞的变化。结果:成功建立免疫型小鼠结肠炎模型。模型组小鼠肠道病理学损伤较正常对照组明显加重;特别是模型组CD4^+ CD29^+ T细胞比例明显高于正常对照组(P<0.01);免疫组织淋巴细胞凋亡指数显著升高(P<0.01);而CD3^+、CD4^+ T细胞较正常对照组明显降低(P<0.05)。经SASP和中药灌肠治疗后,肠道组织病理损伤明显减轻,免疫组织淋巴细胞凋亡指数显著降低,且CD3^+、CD4^+ T细胞亚群较模型组明显增高。结论:DNCB+AA法诱导的小鼠结肠炎模型,是一种较理想的IBD动物模型,可成功用于炎性肠病发病及治疗机制的研究。

不同照射方式对放射复合伤大鼠伤口愈合的影响

目的:建立放射复合伤伤口愈合模型,观察不同照射方式对放射复合伤伤口愈合的影响。方法:清洁级Wistar大鼠90只,按体重随机分为单纯创伤(单伤组)、全身照射+创伤(照伤组)和创伤+伤口局部照射(伤照组)3组。照射采用60Coγ-源单次全身照射5Gy(照伤组)或单次伤口局部照射25Gy(伤照组)。血细胞计数仪观察外周血像的变化;麦格-姬姆萨(MGG)方法检测外周血淋巴细胞凋亡指数;图像分析仪测量伤口愈合面积;病理学观察各组大鼠伤口愈合的动态变化。结果:与单伤组比较,照射后两组体重明显下降,照射后3～28d差异均有显著性,而伤照组体重于照射后3～28d较单伤组和照伤组均明显降低;照射后不同时间两照射组伤口均较单伤组愈合延迟,伤照组于照后3、7、10和15d与单伤组比较差异有显著性,且照射后15和21d伤口面积明显大于照伤组。与单伤组比较,两照射组动物外周淋巴细胞凋亡指数在照射后3d即明显升高,两组均于照射后15d升至最高,分别约为单伤组的1.49和1.62倍(P<0.01);而WBC计数结果表明,照射后1～28d两个照射组WBC均显著低于单伤组(P<0.01)。病理学观察表明,照射后早期伤口出血坏死较为明显;中期伤口区肉芽组织生机不良,毛细血管较少;晚期伤口愈合较慢,伤照组较照伤组愈合延迟4d,较单伤组延迟1周左右。结论:全身照射和伤口局部照射均可使伤口愈合明显延迟,创伤后再局部照射伤口愈合延迟更为明显,约较单伤组延迟1周左右。

重组胸腺素α_1 pMAL-C2x-Tα_1/TB1工程菌三角摇瓶培养条件的优化

目的对重组胸腺素α1pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌的培养条件进行优化。方法在摇瓶培养条件下探讨工程菌的生长和表达规律,对pMAL-C2x-Tα1/TB1菌种的培养基装量、接种量、诱导剂异丙基硫化半乳糖苷(IPTG)加入时间和浓度、诱导时间进行了实验和优化。结果由摇瓶培养获得的数据表明pMAL-C2x-Tα1/TB1最优培养条件为:10%接种量、100 mL LB培养基、37℃培养,接种后3 h,入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导4 h后目的蛋白表达量最高。结论优化的培养条件为菌种的发酵工艺奠定了基础。

重组胸腺素α1的发酵、纯化及药效研究

为获得重组胸腺素α1(recombinant thymosinα1,Tα1),采用融合表达方式表达Tα1基因,重组融合表达载体Tα1/pMAL-C2x转化大肠杆菌TB1构建工程菌。对工程菌进行发酵并诱导表达,得到可溶性表达的目的蛋白。亲和层析纯化融合蛋白MBP-Tα1,经凝血酶裂解融合蛋白,Source Q离子交换,得到Tα1单体,最终目的蛋白纯度大于95%。应用犬细小病毒模型进行抗病毒药效学分析显示,重组Tα1具有抗病毒疗效,其药效与阳性药物日达仙相近。

中药灌肠Ⅰ号对小鼠结肠炎治疗作用及免疫学机制研究

目的:比较中药方灌肠Ⅰ号与西药柳氮磺胺吡啶(SASP)对2,4-二硝基氯苯(DNCB)和乙酸(AA)复合法诱导的小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型的治疗效果,并探寻UC发病机制。方法:将小鼠随机分为正常组、模型组、SASP组及灌肠Ⅰ号治疗组4组,用肠道积分法评定组织学变化;用流式细胞仪检测各组外周血、肠系膜淋巴结中CD3+、CD4+T细胞的变化。结果:模型组小鼠肠道组织学评分明显高于正常组,而结肠长度明显较正常组缩短;模型组CD3+、CD4+细胞较正常组明显降低(P<0.01)。经SASP和灌肠Ⅰ号灌肠治疗后,在肠道炎症和病理损伤明显减轻的同时,肠道组织学评分较模型组明显降低(P<0.01),结肠长度与正常组基本接近,且CD3+、CD4+细胞亚群较模型组明显增高(P<0.01)。结论:灌肠Ⅰ号对DNCB-AA诱导的小鼠UC模型治疗取得了满意效果,可作为UC发病机制的研究及治疗的较理想药物。