骨髓间充质干细胞通过上调EPO表达减轻缺氧损伤引起的PC12细胞凋亡

目的:观察骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)对氯化钴(CoCl2)诱导的PC12细胞缺氧损伤及凋亡的影响并探讨其作用机制。方法:将PC12细胞分为以下几组:空白对照组、CoCl2处理组、BM-MSCs-siCTL+CoCl2处理组和BM-MSCs-siEPO+CoCl2处理组。应用MTT、流式细胞术(FCM)及Hoechst 33258染色法检测BM-MSCs对CoCl2诱导的细胞活性下降及凋亡的影响。采用逆转录PCR(RT-PCR)和Western blotting检测BM-MSCs的促红细胞生成素(EPO)表达情况。同时通过RT-PCR法检测PC12细胞的Bcl-2与Bax表达情况。此外应用分光光度法检测caspase-9和-3活性。结果:MTT结果显示BM-MSCs共培养能够提高PC12细胞活力,0.6 mmol/L CoCl2单独处理组24 h和48 h细胞存活率仅为(43.0±6.4)%和(33.8±5.7)%,1∶15细胞比BM-MSCs共培养24 h和48 h后细胞存活率明显上升,分别为(77.9±3.8)%和(75.2±9.7)%(P<0.01)。RT-PCR和Western blotting显示0.6mmol/L CoCl2处理24 h和48 h明显诱导BM-MSCs的EPO表达上调,而EPO siRNA可完全抑制BM-MSCs的EPO表达(P<0.01)。FCM及Hoechst 33258结果表明CoCl2处理能诱导PC12细胞损伤及凋亡,BM-MSCs-siCTL与PC12细胞共培养可有效抑制CoCl2的细胞毒性作用,减少细胞缺氧性损伤及凋亡,而EPO siRNA可明显阻断BM-MSCs的抗细胞凋亡作用(P<0.01)。RT-PCR结果显示BM-MSCs共培养组PC12细胞的Bcl-2表达较CoCl2处理组明显升高,而Bax表达较CoCl2处理组明显降低;EPO siRNA明显抑制BM-MSCs介导的Bcl-2表达升高和Bax表达降低(P<0.01)。分光光度法结果显示BM-MSCs-siCTL共培养组的caspase-9和-3活性较CoCl2处理组明显降低,而BM-MSCs-siEPO共培养组的caspase-9和-3活性较BM-MSCs-siCTL共培养组明显增加(P<0.01)。结论:BM-MSCs共培养能抑制CoCl2诱导的PC12细胞凋亡,其细胞保护作用的机制可能与其上调EPO的表达有关。

血液生物标志物对预测ICU患者急性肾损伤及判断预后的价值分析

目的探讨血液生物标志物对急性肾损伤(AKI)的预测及判断预后临床价值。方法连续选择2012年10月~2014年11月在浙江省人民医院重症医学科(ICU)住院220例患者为研究对象。所有研究对象均于入住ICU后24 h内留取血液标本检测中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)及肾损伤分子-1(KIM-1)水平,并记录患者的一般临床资料及28 d生存率等。结果共纳入218例患者,其中152例(69.7%)最终发生AKI,发生AKI患者NGAL水平为(234.1±32.5)ng/m L,未发生AKI患者为(63.2±12.4)ng/m L,差异具有统计学意义(P<0.05)。AKI患者KIM-1为(5.26±1.20)ng/m L,未发生AKI患者为(1.47±0.53)ng/m L,差异具有统计学意义(P<0.05)。NGAL预测AKI敏感性及特异性分别为81.6%和81.8%,预测CRRT时机敏感性及特异性为74.4%和66.7%。KIM-1预测AKI敏感性及特异性分别为75.7%和75.8%,预测CRRT时机敏感性及特异性分别为76.7%和75.0%,预测死亡率敏感性及特异性分别为70.1%和68.5%。结论对ICU患者检测血液中的NGAL及KIM-1水平对于早期发现AKI、预测CRRT使用时机及评估患者预后具有极高的临床价值。

血管内皮生长因子对PC12细胞缺氧损伤凋亡的保护作用

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)对氯化钴诱导的PC12细胞缺氧损伤及凋亡的影响并探讨其作用机制。方法应用MTT及Hoechst/PI染色检测VEGF对氯化钴诱导的细胞存活力下降及凋亡的影响。采用RT-PCR和Western-blotting检测XIAP及核转录因子κB(NF-κB)信号蛋白表达情况。采用分光光度法检测Caspase-3活性。结果 MTT结果显示0.6 mmol/L和0.8 mmol/L氯化钴处理PC 12细胞24 h后,VEGF+氯化钴组的细胞活性明显高于氯化钴组,差异有统计学意义(t分别=8.53、5.70,P均<0.05),在0.6 mmol/L氯化钴处理后24 h和48 h,VEGF+氯化钴处理组的细胞活性明显高于氯化钴组,差异有统计学意义(t分别=8.85、7.43,P均<0.05)。RT-PCR和Westernblotting显示氯化钴处理组PC12细胞XIAP m RNA表达水平明显较未给予氯化钴处理的VEGF组下降(t=4.83,P<0.05),而VEGF+氯化钴处理组PC12细胞经氯化钴处理24 h后XIAP m RNA表达水平较氯化钴组明显上升(t=5.71,P<0.05)。VEGF处理可使IκBα蛋白去磷酸化与去泛素化,P65蛋白入核。VEGF+氯化钴处理组的Caspase-3活性比氯化钴处理组明显增加,差异有统计学意义(t=4.81,P<0.05),而VEGF+氯化钴+BAY 11-7085组Caspase-3活性较VEGF+氯化钴处理组明显下降,差异有统计学意义(t=8.17,P<0.05)。Hochest/PI荧光染色显示氯化钴+VEGF组PI阳性细胞较氯化钴组明显减少,而氯化钴+VEGF+BAY11-7085组的PI阳性细胞较氯化钴+VEGF组明显增加。结论VEGF处理能抑制氯化钴诱导的PC12细胞凋亡,其细胞保护作用的机制可能与其激活NF-κB信号有关。

促红细胞生成素对氯化钴诱导的PC12细胞凋亡的拮抗作用

目的观察促红细胞生成素(EPO)对氯化钴(CoCl2)诱导的PC12细胞缺氧损伤凋亡的影响并探讨其作用机制。方法将PC12细胞分为四组:空白对照组、CoCl2处理组、重组人促红细胞生成素(rhE-PO)处理组、rhEPO+CoCl2处理组。应用MTT,乳酸脱氢酶(LDH),流式细胞术(FCM)及Hoechst33258染色法检测rhEPO对氯化钴诱导的细胞活性下降及凋亡的影响。通过逆转录PCR(RT-PCR)法检测Survivin表达情况。结果 MTT结果显示rhEPO预处理能够提高PC12细胞活力,0.6mmol/LCoCl2单独处理组细胞存活率仅为(43.07±5.9)%,rhEPO处理24h后细胞存活率上升明显至(77.89±3.4)%(P<0.01)。LDH检测,FCM及Hoechst33258结果表明CoCl2处理能诱导PC12细胞损伤及凋亡,而预先采用2UrhEPO处理PC12细胞可抑制CoCl2的细胞毒性作用,减少细胞缺氧性损伤及凋亡。RT-PCR显示rhEPO处理组PC12细胞Survivin表达较CoCl2处理组明显升高。结论 EPO处理能抑制CoCl2诱导的PC12细胞凋亡,其细胞保护作用的机制可能与上调PC12细胞的Survivin表达有关。

信号转导和转录活化蛋白在肝胆胰肿瘤及肿瘤干细胞中的作用研究进展

信号转导和转录活化蛋白（STATs）于1994年Darnell等在研究干扰素-α／γ（IFN-γ）诱导基因转录时发现，是一类哺乳动物细胞中具有信号转导和转录调控双重功能的蛋白家族。

HIF-1α修饰的骨髓间充质干细胞增强其抗PC12细胞缺氧损伤作用

该文探讨了HIF-1α修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对缺氧损伤所致神经元样PC12细胞凋亡的作用及其可能机制。PC12细胞分别与MSCs、HIF-1α-MSCs细胞在缺氧环境下体外共培养,分为正常组、缺氧组、MSCs组及HIF-1α-MSCs组。MTT检测不同缺氧时间PC12细胞活性。HE染色观察PC12细胞形态。Hoechst 33258染色与Annexin V-FITC双染色法检测PC12细胞凋亡。RT-PCR及细胞免疫荧光检测caspase-3的m RNA及蛋白质水平。MTT结果显示,PC12细胞活性随着缺氧时间而下降,缺氧12 h细胞活性下降至45.1%。与正常组相比,缺氧组PC12细胞凋亡率明显增高,caspase-3的m RNA和蛋白质水平明显上调,两者有显著差异(P<0.05)。与缺氧组相比,MSCs组及HIF-1α-MSCs组的凋亡率降低(P<0.05),caspase-3的m RNA和蛋白质水平下调(P<0.05),且HIF-1α-MSCs组更为明显(P<0.05)。结果证明,HIF-1α修饰的MSCs能增强MSCs的抗PC12缺氧损伤作用,其机制可能与HIF-1α-MSCs降低PC12细胞caspase-3基因表达有关。

LncRNA TUG1通过调控microRNA-132-3p/SIRT1减轻脂多糖诱导的小肠上皮细胞损伤

目的探讨LncRNA-TUG1在脂多糖(LPS)诱导的小肠黏膜上皮细胞损伤中的作用和机制。方法使用LPS处理HIEC-6人类小肠黏膜上皮细胞24 h构建脓毒症损伤模型。全转录组RNA测序分析LPS处理后HIEC-6细胞中的mRNA、microRNA及lncRNA表达变化。实时荧光定量(qRT-PCR)及western blot检测LncRNA-TUG1、microRNA-132-3p(miR-132-3p)、SIRT1 mRNA及SIRT1蛋白的表达在LPS处理后HIEC-6细胞中的表达变化。体外转染技术改变LncRNA-TUG1、microRNA-132-3p及SIRT1的表达水平。qRT-PCR及western blot分析LncRNA-TUG1对miR-132-3p及SIRT1的表达调控。CCK-8及流式细胞术分析LncRNA-TUG1、miR-132-3p及SIRT1对HIEC-6细胞增殖和凋亡的影响。双荧光素酶报告分析验证LncRNA-TUG1、miR-132-3p及SIRT1之间的靶向关系。统计学分析采用SPSS 17.0进行,两组间的差异比较采用独立样本t检验。结果RNA测序结果显示LPS处理后的HIEC-6细胞中出现LncRNA-TUG1及SIRT1表达降低(t=3.26,P<0.05以及t=2.55,P<0.05),但是miR-132-3p表达升高(t=4.12,P<0.05)。在体外细胞实验中,LPS处理后HIEC-6细胞后,LncRNA-TUG1及SIRT1表达降低(t=5.69,P<0.05以及t=5.712,P<0.05),而miR-132-3p表达升高(t=3.88,P<0.05)。LncRNA-TUG1过表达能够增加LPS处理后细胞的增殖率(t=6.55,P<0.05)同时降低其凋亡率(t=3.94,P<0.05)。上调LncRNA-TUG1可以降低miR-132-3p的表达(t=4.66,P<0.05),同时增加SIRT1 mRNA(t=3.91,P<0.05)及蛋白的水平。转染miR-132-3p mimic可以抑制SIRT1 mRNA(t=4.08,P<0.05)及蛋白的水平。在LPS处理的细胞中,与仅转染pcDNA3.1-LncRNA-TUG的细胞相比,共转染miR-132-3pmimic和siRNA-SIRT1的细胞增殖率较低(t=4.55,P<0.05以及t=5.67,P<0.05),凋亡率较高t=3.90,P<0.05以及t=4.22,P<0.05)。结论lncRNA-TUG1可能作为ceRNA调控miR-132-3p/SIRT1从而减轻LPS造成的HIEC-6细胞损伤。干预lncRNA-TUG1/microRNA-132-3p/SIRT1调控通路可能成为防治脓毒症引起小肠损伤的潜在策略。

微小RNA-224通过靶向抑制p21参与调控脂多糖诱导的肺微血管内皮细胞损伤研究

目的探讨miR-224在脂多糖(LPS)诱导的肺微血管内皮细胞(PMVEC)损伤中的作用及机制。方法分离清洁级BALB/c小鼠(购自浙江大学实验动物中心)原代PMVEC并体外培养,使用1.0 mg/L LPS处理PMVEC以诱导细胞损伤。通过转染miR-224抑制序列或p21的小干扰RNA(siRNA)序列分别下调PMVEC的微小RNA-224(miR-224)及p21表达水平。采用细胞计数试剂盒法及流式细胞仪检测PMVEC的细胞活力变化及凋亡率变化。实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及蛋白质印迹法(Western blot)检测PMVEC的miR-224及p21表达水平。使用双荧光素酶报告实验分析miR-224及p21的靶向关系。两组间的均数比较采用t检验,多组间的均数两两比较在采用单因素方差分析基础上使用最小显著差异法(LSD)检验。结果与未经任何处理的PMVEC比较,LPS处理后细胞相对细胞活力降低至(42.333±7.586)%,凋亡率提高至(32.141±2.449)%,miR-224表达增加至1.791±0.167,p21 mRNA水平降低至0.527±0.058,以上差异有统计学意义(t=8.532、7.261、7.113及8.467,P值均<0.01)。与单纯LPS处理的细胞比较,miR-224下调的细胞在LPS处理后的相对细胞活力增加且凋亡率显著降低,差异有统计学意义(F=62.618、32.643,P<0.01)。抑制p21表达会消除miR-224下调带来的这种保护作用。结论miR-224可能通过靶向抑制p21参与调控LPS诱导的PMVEC损伤。抑制miR-224可能有助于脓毒症后急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征的防治。