miR-24对人脐静脉内皮细胞增殖、转移及自噬的影响

目的探讨miR-24对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、转移、自噬的影响。方法将HUVECs随机分为空白对照组、雷帕霉素+miR-24高表达组、雷帕霉素组。空白对照组不给予任何处理;雷帕霉素组的HUVECs用1 000 nmol/L雷帕霉素处理6 h建立自噬模型。雷帕霉素+miR-24高表达组的HUVECs先转染miR-24高表达质粒,待转染成功后以同样方法建立自噬模型;用CCK-8法检测HUVECs增殖能力,细胞划痕试验检验细胞的转移能力,进一步用免疫组织化学和Western blotting法检测HUVECs自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)和Beclin-1的蛋白表达水平,采用透射电镜观察细胞内部自噬小体。结果与空白对照组相比,雷帕霉素组、雷帕霉素+miR-24高表达组OD值、细胞迁移比例降低、Beclin-1蛋白及LC3Ⅱ蛋白表达量上升(P<0.01或<0.05)。与雷帕霉素组相比,雷帕霉素+miR-24高表达组OD值、细胞迁移比例下降,Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达量下降(P<0.01或<0.05)。透射电镜观察结果显示,空白对照组和雷帕霉素+miR-24高表达组的细胞质内各细胞器分布基本正常,细胞核形态也正常,细胞质中未见明显自噬小体;雷帕霉素组细胞质中可见明显的空泡状结构、包含部分双层膜结构的自噬小体。结论 miR-24可显著抑制HUVECs的增殖、转移及自噬。

微小核糖核酸-24对内皮型一氧化氮合酶基因表达的调节及其对血管内皮细胞管腔形成的影响

目的:探讨微小核糖核酸(microRNA)-24(miR-24)对内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达调节的分子机制及其对血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成能力的影响。方法:构建miR-24及其反义序列的高表达质粒,分别转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),根据转染质粒将实验细胞分为:miR-24高表达组、miR-24干扰组和空白质粒对照组。用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测HUVECs增殖能力,划痕和Transwell试验检测细胞的迁移能力,人工基底膜检测细胞的管腔形成能力;分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测eNOS和Sp1转录因子m RNA和蛋白表达水平。结果:(1)与空白质粒对照组比较,miR-24高表达组细胞增殖能力降低45.45%(0.36±0.04 vs 0.66±0.08,P<0.05);miR-24高表达组细胞迁移速度明显减缓,且迁移数目降低74.75%(30.25±3.78 vs 119.80±10.94,P<0.01),未能形成明显管腔样结构。(2)与空白质粒对照组比,miR-24高表达组eNOS m RNA降低46.2%(0.49±0.02vs 0.91±0.01,P<0.05),蛋白表达减少49.07%(0.55±0.05 vs 1.08±0.05,P<0.05);同时Sp1 m RNA降低44.9%(0.49±0.01 vs 0.89±0.02,P<0.05),其蛋白质表达量也相应减少54.90%(0.46±0.02 vs 1.02±0.04,P<0.05)。在miR-24抑制组中,上述指标较空白质粒对照组降低,但比miR-24高表达组显著升高,特别是小管形成数量、及管腔长度与空白质粒对照组相近。结论:miR-24显著抑制HUVECs的增殖、迁移和管腔形成的能力,并且与miR-24对eNOS的表达调控有关;miR-24明显抑制eNOS表达,Sp1的参与可能是这一调节过程的重要分子机制之一。

microRNA-24对自噬的调节及血管内皮细胞管腔形成的影响

目的探讨microRNA-24(miR-24)对自噬相关基因LC3Ⅱ和Beclin-1的调节及其对血管内皮细胞管腔形成能力的影响。方法将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)随机分为空白对照组、雷帕霉素+miR-24高表达组以及雷帕霉素组。其中空白对照组的细胞不作任何处理;雷帕霉素+miR-24高表达组的细胞先转染miR-24高表达质粒,再用1 000 nmol/L的雷帕霉素干预6 h建立自噬模型;雷帕霉素组的细胞同样用1 000 nmol/L的雷帕霉素干预6 h建立自噬模型;然后分别用MTT法检测HUVECs的增殖能力、细胞划痕实验检测HUVECs迁移能力及Matrigel实验检测HUVECs管腔形成能力,进一步用蛋白免疫印迹法(Western blot)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测LC3II和Beclin-1的蛋白和mRNA表达水平。结果 (1)与空白对照组相比,雷帕霉素组、雷帕霉素+miR-24高表达组细胞增殖能力和迁移比例降低(P<0.05),雷帕霉素组的管腔形成数量、长度与空白对照组相近,而雷帕霉素+miR-24高表达组则基本没有形成明显管腔样结构。(2)与空白对照组相比,雷帕霉素+miR-24高表达组和雷帕霉素组的LC3II和Beclin-1 mRNA和蛋白表达量均不同程度增加(P<0.05)。(3)在雷帕霉素+miR-24高表达组中,上述指标较雷帕霉素组均降低(P<0.05),特别是管腔形成数目明显减少。结论 miR-24可在转录后水平调控自噬相关基因LC3II和Beclin-1的表达,进而下调细胞自噬水平。这很有可能是miR-24抑制HUVECs增殖、迁移和管腔形成的机制之一。

内含子源性27nt-miRNA对内皮型一氧化氮合酶表达调节及血管内皮细胞管腔形成的影响

目的:探讨内含子源性27nt-miRNA对内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达调节的分子机制及其对血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成能力的影响。方法:构建wt-27nt-miRNA、mut-27nt-miRNA和空白对照序列的高表达质粒,分别转染人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),采用RT-PCR、Western blotting检测eNOS mRNA和蛋白表达水平;MTT检测HUVECs增殖能力,划痕和Transwell实验检测HUVECs的迁移能力,Matrigel检测HUVECs的管腔形成能力。结果:(1)与空白质粒对照组比较,wt-27nt-miRNA表达组HUVECs eNOS mRNA降低39.51%(0.49±0.02vs 0.81±0.02,P<0.05),其蛋白质表达量下降47.41%(0.71±0.07vs 1.35±0.06,P<0.05)。(2)与空白质粒对照组相比,wt-27nt-miRNA表达组HUVECs增殖明显减少,抑制率为41.86%;wt-27nt-miRNA表达组HUVECs迁移速度明显减缓,且迁移数目降低75.55%(28.75±1.71vs117.60±4.45,P<0.01),未能形成明显管腔样结构。在mut-27nt-miRNA表达组中,上述指标比空白质粒对照组降低(P<0.05),但比wt-27nt-miRNA表达组显著升高(P<0.05),特别是管腔形成数量及管腔长度与空白质粒对照组相近。结论:内含子源性27nt-miRNA显著抑制HUVECs的增殖、迁移和管腔形成的能力,并与内含子源性27nt-miRNA对eNOS表达的调控相关。

AS-miR-21对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移及对PTEN/PI3K/Akt信号通路的作用

目的探讨miR-21的反义寡核苷酸(AS-miR-21)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖和迁移能力的影响及对PTEN/PI3K/Akt信号通路的调控作用机制。方法将NSCLC A549细胞分为3组,分别为AS-miR-21组、miR-NC组和Blank组,前两组分别应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染ASmiR-21及阴性对照miRNA(miR-NC),后者未进行任何干预。应用qRT-PCR检测AS-miR-21对NSCLC A549细胞中miR-21表达的影响;应用MTT检测NSCLC A549细胞增殖抑制率;Giemsa染色检测NSCLC A549细胞克隆形成;细胞划痕实验检测NSCLC A549细胞迁移潜能;qRT-PCR检测AS-miR-21对NSCLC A549细胞中PTEN mRNA表达水平的影响;蛋白质免疫印迹法检测AS-miR-21对NSCLC A549细胞中PTEN、PI3K、Akt蛋白表达水平的影响。结果与miR-NC组和Blank组比较,AS-miR-21组miR-21表达水平下调(P<0.05);ASmiR-21显著抑制NSCLC A549细胞增殖能力(P<0.05),显著减少NSCLC A549细胞克隆形成(P<0.01)和迁移率(P<0.01);AS-miR-21显著上调NSCLC A549细胞中PTEN蛋白表达水平(P<0.01),而显著下调PI3K和Akt蛋白表达水平(P<0.01)。结论 AS-miR-21能抑制NSCLC A549细胞增殖及迁移,此外,AS-miR-21通过负调控PTEN/PI3K/Akt信号通路有可能成为NSCLC治疗新靶点。

miR-21抑制剂对血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞增殖及eNOS表达的影响

目的:探讨miR-21抑制剂对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响。方法:将miR-21抑制剂转染至经AngⅡ诱导的HUVECs,采用MTT法检测细胞的增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,分别采用RT-PCR和western blotting法检测转录因子AP1和eNOS的mRNA和蛋白表达水平。结果:AngⅡ能促进HUVECs增殖和迁移,并使细胞中AP1、eNOS mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05);miR-21抑制剂转染细胞后,AngⅡ促进HUVECs增殖和迁移的作用发生显著逆转(P<0.05),且AP1、eNOS mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论:miR-21抑制剂能够抑制AngⅡ刺激下HUVECs的增殖及eNOS的表达;AP1在AngⅡ诱导细胞eNOS表达中可能起到关键的调控作用。

miRNA-24对血管内皮细胞eNOS表达/活性及其代谢产物NO生成的影响

目的探讨微小RNA(miRNA)-24对血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(e NOS)基因表达、活性调节的分子机制及其代谢产物的影响。方法构建miRNA-24高表达质粒,并转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。MTT法检测细胞的增殖情况,划痕实验检测细胞的迁移能力,RT-PCR和Western印迹法检测细胞eNOS mRNA和蛋白的表达情况,ELISA法检测eNOS的表达活性,硝酸还原法测定细胞培养上清液中NO的含量。结果与对照组相比,转染miRNA-24后细胞增殖能力下降54.32%、迁移能力下降48.62%;转染miRNA-24后eNOS mRNA降低43.92%,蛋白表达量减少42.71%;转染miRNA-24后eNOS的酶活性降低73.20%,同时NO的合成与释放减少55.29%。结论 miRNA-24高表达抑制eNOS的表达及酶活性;miRNA-24抑制代谢产物NO的合成与释放,这可能成为心血管疾病防治的分子靶点。

人骨髓间充质干细胞定向血管内皮细胞诱导分化前后eNOS表达/活性及其代谢产物的差异

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)定向血管内皮细胞诱导分化前后内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达、活性及其代谢产物的差异。方法建立hBMSCs定向血管内皮细胞诱导分化系统。应用倒置显微镜观察细胞形态的改变,Transwell实验检测细胞的迁移能力,细胞免疫荧光及Western blot检测eNOS的蛋白表达,ELISA法检测eNOS的活性,硝酸还原法检测细胞培养上清液NO含量。结果与未分化组相比,分化后的细胞形态发生明显改变;细胞的迁移能力增强238.10%(73.000±7.002 vs.21.000±4.359,P<0.05);eNOS蛋白的表达增加114.72%(0.423±0.011 vs.0.197±0.079,P<0.05);eNOS的活性增强157.49%(4.967±0.073 vs.1.929±0.103,P<0.05);NO合成与释放增加155.67%(184.909±1.853 vs.72.323±0.426,P<0.05)。结论 hBMSCs定向内皮细胞诱导分化后eNOS基因表达增加、活性增强,其代谢产物NO的合成与释放增加。本结果可能为干细胞在心血管疾病等防治提供依据。

长链非编码RNA LINC01410对B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)LINC01410对B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)细胞增殖和凋亡的影响。方法采用Cox回归模型筛选GEO数据集(GSE10846)中与B-NHL预后相关的LncRNA。将体外培养B-NHL细胞系Raji和Ramos,随机分为慢病毒对照组、LINC01410敲低组、多柔比星组、LINC01410敲低+多柔比星组,各组给予相应的慢病毒转染和多柔比星处理。采用实时荧光定量PCR法检测B-NHL细胞系中LINC01410 RNA的相对表达水平,采用细胞计数检测法检测各组B-NHL细胞的细胞活力,采用流式细胞术检测B-NHL细胞的凋亡情况,采用蛋白质免疫印迹法检测B-NHL细胞中多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)蛋白的相对表达水平。结果共筛选出30个高风险LncRNA,风险比的范围为2.41~20.80,其中LINC01410的风险比为2.51。在Raji、Ramos细胞系中,慢病毒对照组、LINC01410敲低组、多柔比星组、LINC01410敲低+多柔比星组的细胞活力依次降低,细胞凋亡率依次升高(均P<0.05);多柔比星组与LINC01410敲低+多柔比星组的PARP蛋白相对表达水平均较慢病毒对照组升高,LINC01410敲低+多柔比星组的PARP蛋白相对表达水平较多柔比星组升高(均P<0.05)。LINC01410过表达的B-NHL患者的生存时间短于LINC01410低表达者(P<0.05)。结论LINC01410过表达提示B-NHL患者预后不良。LINC01410敲低可上调凋亡蛋白PARP的表达,促进B-NHL细胞凋亡,抑制B-NHL细胞活力,与多柔比星联用可产生增效协同作用。

LncRNA ZEB1-AS1对B细胞非霍奇金淋巴瘤增殖和凋亡的影响及其下游调控网络的分析

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)ZEB1-AS1对B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin′s lymphoma,B-NHL)细胞增殖和凋亡的影响,构建lncRNA、miRNA、mRNA相关竞争性内源RNA(ceRNAs)网络。方法采用Cox回归模型筛选GEO数据集(GSE31312)中与弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)预后相关的lncRNAs。采用慢病毒转染技术建立ZEB1-AS1敲低的B-NHL细胞模型,采用CCK-8法和流式细胞术分别检测敲低ZEB1-AS1及不同浓度(50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)多柔比星(doxorubicin,Dox)处理后的细胞增殖与凋亡情况。构建以ZEB1-AS1为节点的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络,利用GO、KEGG和PPI分析该调控网络下游相关的核心mRNA及其功能。结果共筛选了20个高风险lncRNAs。预测与ZEB1-AS1有相互结合的miRNA 4个,与ZEB1-AS1呈共表达关系又与miRNA相结合的潜在下游mRNA 1208个,以此构建lncRNA-miRNA-mRNA调控网络及PPI调控网络。在体外实验中,与空载组相比,敲低ZEB1-AS1可显著抑制细胞增殖和促进细胞凋亡(均P<0.05),敲低ZEB1-AS1+Dox作用对抑制淋巴瘤细胞增殖和促进细胞凋亡有协同作用。结论ZEB1-AS1敲低可抑制B-NHL细胞增殖和促进细胞凋亡,且可能增强Dox的药物敏感性;以ZEB1-AS1为节点构建的ceRNA调控网络,可能是DLBCL重要的调控机制和诊疗靶点。

27-nt miRNA对血管内皮细胞eNOS表达/活性的调节及其代谢产物的影响

目的:前期工作表明,27-nt miRNA对eNOS的转录和表达有负反馈调节作用。本实验进一步探讨27-nt miRNA对血管内皮细胞eNOS的基因表达、活性调节及其代谢产物的影响。方法:构建27-nt miRNA高表达质粒,并将其转染至HUVECs。MTT法检测细胞的增殖情况,划痕实验检测细胞的迁移能力,Western Blot检测27-nt miRNA及细胞eNOS蛋白的表达情况,ELISA法检测eNOS活性,硝酸还原法测定细胞培养上清液中NO的含量。结果:27-nt miRNA对HUVECs的增殖有强烈的抑制作用(0.674±0.093 vs 0.315±0.013,0.743±0.076 vs 0.315±0.013,P<0.05);27-nt miRNA对HUVECs的迁移有显著的抑制作用(0.483±0.009vs 0.806±0.017,0.465±0.047 vs 0.806±0.017,P<0.05);27-nt miRNA显著降低eNOS蛋白的表达(0.410±0.004 vs 0.645±0.007,0.483±0.009 vs 0.645±0.007,P<0.05)及明显抑制eNOS的活性(1.093±0.357 vs 5.034±0.509,1.707±0.652 vs 5.034±0.509,P<0.05);27-nt miRNA明显抑制NO的合成与释放(70.687±4.432 vs 136.803±6.913,75.264±4.481 vs 136.803±6.913,P<0.05)。结论:27-nt miRNA高表达明显抑制eNOS基因的表达及活性;27-nt miRNA明显抑制NO的合成和释放,可能成为血管性疾病治疗的分子靶点。