斑马鱼早期胚胎发育过程中IL-1β表达的特点

目的 探讨野生型斑马鱼胚胎早期发育中白细胞介素1β(IL-1β)的表达特点。方法 选取美国国家生物信息技术中心(NCBI)数据库中人类、斑马鱼、猪、绵羊、水牛、小鼠、大鼠、家兔以及豚尾猴9个不同物种IL-1β氨基酸序列进行同源性比对,采用分子进化遗传分析软件(MEGA X)绘制系统进化树;收集4组72受精后小时(hpf)斑马鱼胚胎、25枚/组,提取总RNA及合成互补脱氧核糖核酸(cDNA),构建pGEMT-IL-1β重组质粒并合成地高辛标记的IL-1β反义RNA探针;分别收集4、6、9、12、18、24、48及72 hpf斑马鱼胚胎、25枚/组,采用整胚原位杂交技术检测IL-1β在斑马鱼早期不同时间胚胎发育中的表达及分布状况。结果 IL-1β氨基酸序列在不同物种中相对保守;限制性内切酶双酶切重组质粒及测序结果显示,重组质粒构建无误;原位杂交实验结果表明,4 hpf斑马鱼胚胎中开始观察到IL-1β阳性杂交信号表达,6~12 hpf斑马鱼胚胎中观察到IL-1β阳性杂交信号持续表达,12 hpf斑马鱼胚胎中表达尤为明显,18 hpf斑马鱼胚胎躯干背侧、眼睛以及中后部中间细胞群等部位观察到不同程度的IL-1β阳性杂交信号表达,24 hpf斑马鱼胚胎全身躯干观察到IL-1β广泛表达,且头部及眼睛部位表达尤为明显,48~72 hpf斑马鱼胚胎观察到IL-1β表达逐渐从头部延伸至全身躯干且于肌肉组织中表达尤为明显。结论 斑马鱼IL-1β在进化过程中具有相对保守性,斑马鱼早期胚胎发育过程中IL-1β有不同程度的表达。

斑马鱼早期胚胎发育过程中IL-10表达的特点

目的探讨野生型斑马鱼白细胞介素10(IL-10)在胚胎早期发育过程中的表达特点。方法在美国国家生物信息技术中心(NCBI)数据库中分别查询人类、小鼠及斑马鱼染色体中IL-10的基因位置,与Ensemble数据库中的数据进行比对,采用软件分子进化遗传分析软件(MEGA X)绘制系统进化树;收集3组72受精后小时(hpf)斑马鱼胚胎、30枚/组,提取总RNA(Total RNA)及合成互补脱氧核糖核酸(cDNA),构建斑马鱼重组质粒pCS^(2+)-IL-10,体外转录合成地高辛标记的IL-10反义RNA探针;分别收集4、6、9、12、18、24、48及72 hpf的斑马鱼胚胎75枚(25枚/组、3组),采用全胚胎原位杂交技术检测斑马鱼胚胎不同发育时间点IL-10表达及分布情况。结果野生型斑马鱼IL-10基因与人类IL-10基因相似度较高,且在进化过程中相对保守;限制性内切酶双酶切重组质粒及测序结果显示,重组质粒构建无误;全胚胎原位杂交结果显示,4~12 hpf野生型斑马鱼胚胎中未观察到阳性杂交信号,18 hpf野生型斑马鱼胚胎中后部中间细胞群观察到IL-10阳性杂交信号,24~72 hpf野生型斑马鱼胚胎胚胎头部区域IL-10广泛表达,头部背侧、心脏、眼眶以及卵黄囊背侧部位的信号尤为明显。结论斑马鱼IL-10在进化过程中具有相对保守性,在早期胚胎发育过程中IL-10有不同程度的表达,提示IL-10在斑马鱼胚胎早期发育中发挥重要作用。

1-苯基2-硫脲对Tg(abcb4:eGFP)斑马鱼肿瘤多重耐药相关基因表达的影响

目的探讨去色素药物1-苯基2-硫脲(PTU)对Tg(abcb4:eGFP)斑马鱼肿瘤多重耐药相关基因abcb4及其标记基因egfp表达的影响及可能机制。方法选取受精后24 h(24 hpf)Tg(abcb4:eGFP)斑马鱼胚胎做药物暴露实验,分为Control、PTU以及PTU+RES 3个组;持续用药96 h,通过荧光显微镜拍照检测各组斑马鱼胃肠道荧光强度;RT-qPCR检测abcb4、egfp及pxr基因mRNA,Western Blot检测abcb4、egfp蛋白(Abcb4、eGFP)的表达,罗丹明B积累实验检测不同组Abcb4功能。结果与Control组相比,PTU组Tg(abcb4:eGFP)斑马鱼荧光表达增强(P<0.01),PTU+RES组荧光变化不明显(P>0.05);PTU组abcb4、egfp及pxr基因mRNA表达均增加(P<0.005),PTU+RES组pxr基因mRNA表达增加(P<0.005),abcb4、egfp基因mRNA表达无明显变化(P>0.05);PTU组abcb4、egfp蛋白表达均增加(P<0.005),PTU+RES组无明显变化(P>0.05);PTU组Abcb4功能增强(P<0.01),PTU+RES组无明显变化(P>0.05)。结论PTU可诱导Tg(abcb4:eGFP)斑马鱼abcb4和egfp表达增加,核因子pxr可能参与PTU对abcb4和egfp的诱导调节过程,在应用PTU去色素处理的Tg(abcb4:eGFP)斑马鱼进行药物筛选时需注意PTU对abcb4和egfp表达的影响。