结核分枝杆菌对CD4+T细胞白细胞介素6受体3′非翻译区甲基化的作用及机制研究

目的研究DNA甲基化在结核分枝杆菌(MTB)裂解物诱导CD4+T细胞白细胞介素6受体(IL-6R)表达下调中的作用及机制。方法本研究属于前瞻性研究。收集并分选2019—2020年深圳市第三人民医院10名健康人(对照组)和10例结核病患者(TB组)外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+T细胞,亚硫酸氢盐测序法分析IL-6R启动子区和3′非翻译区(UTR)区CpG岛甲基化变化;RT-qPCR和Western blotting分别检测IL-6R和DNA甲基转移酶(DNMT)表达;进一步通过MTB裂解物刺激anti-CD3/CD28抗体活化的对照组PBMC和Jurkat E6-1细胞,检测IL-6R不同区域CpG岛甲基化和IL-6R、DNMT表达的变化;双荧光素酶报告基因系统检测IL-6R 3′UTR区甲基化状态对其转录活性的影响;两组间采用非配对t检验,三组及以上多组运用one-way ANOVA分析。结果在对照组和TB组外周血CD4+T细胞中,TB组中IL-6R表达低于对照组,而DNMT1和DNMT3B则高于对照组;且与对照组比,IL-6R启动子CpG岛甲基化水平差异无统计学意义;3′UTR区CpG岛甲基化率分别为54.3%±4.7%和69.5%±3.4%,差异有统计学意义(P<0.001);在体外,MTB裂解物刺激活化对照组PBMC后,IL-6R表达低于未刺激的,而DNMT1和DNMT 3B表达高于未刺激的;同时CD4+T细胞中IL-6R 3′UTR区CpG岛甲基化率由58.9%±11.6%增加至79.4%±10.9%,差异有统计学意义(P<0.001);同样地,MTB刺激活化Jurkat E6-1细胞后的结果与对照组PBMC相一致。进一步发现DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨(5-aza)与MTB裂解物共处理后IL-6R的表达均高于MTB裂解物单独刺激的;DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨(5-aza)与MTB裂解物共处理后IL-6R 3′UTR区CpG岛甲基化水平低于MTB裂解物单独刺激的,并且完全非甲基化修饰的IL-6R 3′UTR报告基因的转录活性高于完全甲基化修饰的IL-6R 3′UTR区CpG岛。结论MTB裂解物刺激通过诱导CD4+T细胞IL-6R 3′UTR区CpG岛高甲基化抑制IL-6R转录活性进而下调其表达;MTB诱导CD4+T细胞IL-6R 3′UTR区CpG岛高甲基化可能与DNMT1、DNMT3B表达增加有关。

柑橘木虱速激肽相关肽基因Dc-TRP克隆及表达分析

【目的】昆虫速激肽相关肽(Tachykinin-related peptides,TRPs)属于肽类神经递质,参与调控昆虫生长、发育、变态、繁殖等多种生命活动。本文旨在探究柑橘木虱Diaphorina citri速激肽相关肽(Dc-TRP)基因序列信息,进一步分析其在不同发育时期及成虫不同组织中的表达情况。【方法】本文克隆得到柑橘木虱速激肽相关肽全长序列,并根据核苷酸系列进行系列分析及结构预测。利用RT-q PCR对柑橘木虱不同发育时期及成虫不同组织部位Dc-TRP的表达情况进行分析。【结果】(1)Dc-TRP编码区全长600 bp,预测编码199个氨基酸,具有多个保守区域。(2)时空表达结果表明Dc-TRP在各发育时期和组织均有表达,其中各发育历期表达差异不明显,而组织中表达差异显著且头部表达最高。【结论】Dc-TRP在柑橘木虱不同发育时期表达无显著性差异,但在成虫不同组织中差异显著。以上实验结果具有一定的生物学意义,为进一步研究Dc-TRP的生理功能提供一定的理论基础。