单核细胞单层试验在预测IgG抗-M相关胎儿新生儿溶血病中的应用

目的探讨单核细胞单层实验(monocyte monolayer assay,MMA)是否能够用于IgG抗-M相关胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of fetus and newborn,HDFN)的预测。方法选取8例含有IgG抗-M的孕妇并采集血浆标本,其中有胎儿水肿等严重临床症状及无明显临床症状的各4例;8份血浆用二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)灭活,与M抗原阳性红细胞孵育致敏后,将致敏红细胞与单核细胞混合进行吞噬试验,同时设立阳性及阴性对照,并计算吞噬率;采用t检验对2组吞噬率进行比较。结果4例发生严重抗-M相关HDFN的孕妇的MMA吞噬率分别为15.37%、13.05%、9.17%和24.50%,均值为15.52%;检出IgG抗-M但未发生HDFN的孕妇,其MMA吞噬率分别为8.74%、11.07%、5.12%和6.23%,均值为7.79%,2组吞噬率无差异(P>0.05)。2组吞噬率分别与阴性对照比较均无差异(P>0.05),但均明显低于阳性对照(P<0.05)。结论IgG抗-M介导单核细胞吞噬的能力较低,提示抗-M导致胎儿水肿的机制可能并非红细胞被吞噬破坏而发生的溶血,因此体外单核细胞单层实验可能不适用于IgG抗-M相关HDFN的预测。对于检出IgG抗-M的孕妇,现仍需通过定期监测胎儿大脑中动脉血流,来判断胎儿宫内贫血情况。

罕见抗-Di^(b)致严重胎儿新生儿溶血病的实验室检测与相关研究

目的对1例高频抗体导致的胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN)进行检测、鉴定及配血。方法对患儿进行新生儿溶血试验,对母亲进行血清学意外抗体鉴定,并对母亲红细胞进行常见高频抗原鉴定;对检出抗体进行IgG分型检测,并用流式细胞术进行单核细胞体外吞噬致敏红细胞试验,以检测抗体相关的吞噬率;对患儿母亲、父亲及舅舅进行相关红细胞血型基因测序;利用稀释的母亲血浆和抗人球卡法,在献血者中进行大规模相合血液的筛选。结果产妇鉴定为Di(b-)稀有血型,产生了抗-Di b(效价512)并导致了严重的HDFN;抗-Di b亚型分型为IgG1和IgG2型,单核细胞体外吞噬效率为88.83%(74.7/84.09);产妇亲属中没有相合献血者,后续从5520名献血者中筛选到2例Di(b-)相合血液,患儿接收输血治疗后康复出院。后续在51334名献血者中筛查到17名Di(b-)献血者,该数据表明Di(b-)在广州地区献血者中的分布频率约为三千分之一(0.033%,17/51334)。结论综合利用血型血清学及分子生物学方法诊断了抗-Di b所致的严重HDFN,建立了1种有效大规模筛查Di(b-)稀有血型的方法并找到相合血液,为建立Di(b-)稀有血型库奠定了基础。

RhD双群患者的血清学及分子生物学分析--附1例报道

目的对1名配血困难的RhD双群(double population,DP)患者进行血清学及分子生物学分析,解决其RhD血型鉴定及临床用血问题。方法用毛细管离心法分离患者红细胞,对近心端、远心端红细胞分别进行ABO和Rh血型鉴定,以及直接抗人球蛋白试验;对患者血浆进行不规则抗体筛选及鉴定以及交叉配血试验;采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测RHD基因合子型,采用序列特异性聚合酶链反应(PCR-SSP)进行RHD和RHCE基因型检测。结果血型鉴定的结果显示该患者血型为B型,RhD及RhCE的c和E血型抗原均为DP,直抗阳性,抗体筛查及鉴定结果显示血浆中含有抗-D;PCR-RFLP结果显示该患者RHD基因盒子型为D-/D-纯合子,即为RHD编码基因缺失型所致的RhD阴性;PCR-SSP的结果也显示该患者RHD编码基因外显子均缺失,RHD基因型为RHD*01N.01/01N.01,RHCE基因型为Ccee。结论本例患者在急救情况下输注了RhD阳性血液,之后被误判为RhD阳性血型,实则为RhD阴性血型。本中心在血型鉴定为DP时,利用分子生物学方法对患者进行了Rh血型准确鉴定,为该患者的精准临床用血提供了依据。

抗-CD47单克隆抗体对输血前检测试验的干扰及处理措施——附1例报告

目的探讨抗-CD47单克隆抗体对输血前检测试验的干扰及处理措施。方法收集1名接受抗-CD47单克隆抗体治疗的骨髓增生异常综合征受试者标本,进行ABO和Rh血型抗原鉴定,直接抗球蛋白试验,不规则抗体筛选和抗体鉴定试验,交叉配血试验;收集多人份O型献血者血小板制备成压积血小板,与受试者血浆进行吸收试验;收集Rh抗原分型分别为CCDee、ccDEE和ccdee的O型红细胞各1人份,分别与受试者血浆进行吸收试验;使用缺乏IgG4的抗球蛋白试剂Gamma-clone进行抗体筛选与交叉配血试验,使用Immucor Capture-R固相凝集试剂盒进行不规则抗体筛选试验。结果受试者直接抗球蛋白为阳性,游离抗体筛选和鉴定试验在所有介质中均为阳性(3+~4+);血浆与红细胞多次吸收后,抗体筛选和抗体鉴定为阴性;与多次血小板吸收后,抗体筛选和抗体鉴定仍为阳性;使用Gamma-clone抗球试剂进行不规则抗体筛选和配血试验,结果均为阴性;Immucor Capture-R固相凝集试剂盒进行不规则抗体筛选试验,结果为阴性。结论抗-CD47单克隆抗体可干扰输血前检测及交叉配血,使用缺乏检测IgG4的抗球蛋白试剂Gamma-clone和Immucor capture-R固相凝集法可较好去除抗-CD47干扰。

混合意外抗体分离鉴定与配血路径——附1例报告

目的探讨疑难配血中混合意外抗体鉴定方法及配血方案。方法鉴定红细胞血型,并对患者血清进行抗体筛查及抗体鉴定,再利用特定血型分型红细胞与患者血清吸收放散,放散液进行抗体鉴定。结果患者血型为O型,ccDEE、JK(a-b+)、NN,患者血清与特定血型红细胞吸收放散后,放散液抗体鉴定结果为抗-Ce、抗-Jka、抗-M。结论通过运用血清学实验确定抗体特异性,选择合理的配血方案,为患者选择合适的血液,确保输血安全。

广州地区无偿献血者稀有血型Lu(a-b-)表型筛查及分子遗传背景研究

目的了解广州地区无偿献血者中Lu(a-b-)表型的频率;通过检测Lutheran血型系统编码LU基因和In(Lu)表型相关红细胞转录因子编码KLF1基因,了解Lu(a-b-)表型的分子遗传背景。方法运用血型血清学方法对5 000名广州地区无偿献血者的Lub抗原进行筛查,对筛选到的Lub阴性个体,用抗球微柱凝胶卡进行Lu(ab-)表型确认,扩增Lu(a-b-)表型先证者LU基因15个外显子和KLF1基因3个外显子并进行测序,通过基因序列比对分析测序结果。结果在广州地区5 000名无偿献血者中筛选到2名Lu(a-b-)表型先证者。测序结果显示,2名先证者LU编码基因编码区及邻近内含子区域未发现任何杂合或纯合突变,进一步分析KLF1基因,发现先证者1携带KLF1基因外显子2的c.895C>G(p.His299Asp)杂合突变,先证者2携带KLF1基因外显子2的c.519_526dup CGGCGCC(p.Gly176Argfs*179)杂合突变。结论 Lu(a-b-)表型在广州地区献血者中的频率约为0.04%(2/5 000)。2例均为In(Lu)表型,其表型形成机制与KLF1基因突变相关。

Cromer血型系统抗-IFC的鉴定及特征分析——附1例报告

目的探讨Cromer血型系统抗体抗-IFC的鉴定方法并分析其特性。方法使用试管法鉴定患者ABO血型,使用Rh分型卡鉴定患者Rh血型;使用抗球微柱凝集法对患者血清进行不规则抗体筛选及抗体鉴定;患者血清分别与用抗胰蛋白酶、胰酶和菠萝酶处理的谱细胞进行反应,初步判定其抗体的特异性;用CD55重组蛋白对患者血清进行中和试验,确定其特异性;对Cromer血型系统调控基因DAF进行测序;用流式细胞术对患者红细胞表面CD55抗原表达量进行检测。结果患者血型为B型,CcDEe;患者血清与未经酶处理谱细胞反应凝集强度均为4+;与胰酶和菠萝酶处理后的谱细胞均为4+;与二硫苏糖醇处理谱细胞反应强度减弱至2+^(s);与抗胰蛋白酶处理后谱细胞反应为阴性,其血清中的抗体可被CD55重组蛋白中和,DAF测序无发现突变位点;流式显示该患者CD55抗原存在缺失。结论该抗体为Cromer血型系统高频抗体抗-IFC,考虑为患者在患病期间因消化道疾病因素导致Cromer血型抗原减弱。

地中海贫血患儿多次输血引起抗-cE抗-Mur疑难配血1例

在临床上,输血是血液系统疾病的重要辅助治疗手段。通过输血,血液系统疾病患者病情得到稳定,但是反复、多次、长期的输血给血液病患者带来极大的风险,同时增加临床配血工作的难度。笔者在工作中发现1例地中海贫血患儿有Ig抗-cE合并抗-Mur混合抗体,现报道如下。

广州地区无偿献血者抗-Mur筛查及Mur抗原基因型检测

目的了解广州地区无偿献血者中抗-Mur及Mur抗原基因型的频率,为指导临床输血及产前抗体监测提供依据。方法用微柱凝胶卡方法筛查2725名献血者血清中37℃有活性的抗-Mur;采用多重连接依赖的探针扩增技术(MLPA)对91名献血者的Mur抗原基因型进行检测,然后用人源抗-Mur血清检测Mur抗原基因型阳性样本的红细胞表型。结果无偿献血者血清中抗-Mur频率为0.04%(1/2725),Mur抗原基因型阳性频率为6.59%(6/91),经血型血清学方法验证基因型与表型符合率为100%(6/6)。结论广州地区无偿献血者中抗-Mur频率较低,而Mur抗原阳性则相对较常见;通过MLPA方法检测Mur抗原基因型可以准确推断其表型,解决了因缺乏商品化抗-Mur试剂导致Mur抗原鉴定难以开展的难题。

高通量红细胞血型基因分型的多重连接依赖的探针扩增技术在一例抗Di^a新生儿溶血病诊断中的应用

目的运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖的探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)辅助诊断一例罕见的由抗Di^a导致的严重核黄疸新生儿溶血病。方法运用传统的血型血清学方法对导致新生儿溶血病相关红细胞血型抗体进行鉴定,运用MLPA对患儿及其父母的超过40种红细胞血型抗原进行基因分型,对鉴定的抗体进行效价分析。结果血型血清学检测表明患儿体内含有针对某种低频抗原的抗体,MLPA基因分析结果提示母婴红细胞MNS血型系统及Diego血型系统抗原不匹配,可能存在抗N或抗Di^a,经进一步的血型血清学检测,证实母亲及患儿血清中存在抗Di^a,并且其母亲血清抗Di^a效价为1:32。结论抗Di^a可引起包括核黄疸在内的严重新生儿溶血病;高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够协助并有效解决临床疑难样本稀有血型鉴定;针对国人的Di^a阳性的试剂红细胞应该常规应用于日常的抗体筛查工作中。

混合抗体型自身免疫性溶血性贫血的血型定型和抗体鉴定

【目的】建立合适的方法解决混合抗体型自身免疫性溶血性贫血的血型定型和抗体鉴定。【方法】分离标本的血清和红细胞,将红细胞进行轻度热放散和氯喹放散实验后,用于ABO正定型、Rh血型抗原分型和后续的自身吸收实验;取适量患者血清,加入等量O型红细胞进行抗体吸收,吸收后的血清用于ABO反定型实验;分别采用PEG法和自身吸收法对自身抗体进行吸收,比较两者的吸收时间、吸收次数、吸收后血清抗体鉴定结果;取适量红细胞进行乙醚放散,放散液用于抗体鉴定。【结果】21例患者的ABO血型得到正确鉴定,15例患者的Rh血型进行了正确定型。2种吸收方法处理后的血清抗体检测结果一致:检出自身抗体合并同种抗体7例,其中4例同种抗体得到确认,3例同种抗体特异性未明确;单纯自身抗体14例。PEG法总吸收时间为825 min,平均为39.3 min;总吸收次数55次,平均每例吸收2.6次;自身细胞放散后吸收实验总耗时为2 070 min,平均为98.7 min;总吸收次数66次,平均每例吸收3.1次。【结论】轻度热放散结合氯喹放散法适用于混合抗体型AIHA患者血型定型前的红细胞处理;PEG吸收法快速、简便、吸收效果好,适合用于临床实际工作。

广州地区无偿献血者人群中Jk(a-b-)表型筛选及分子遗传学研究

目的了解广州地区无偿献血者人群中,Kidd血型系统中Jk(a-b-)稀有血型个体的分布频率及分子遗传背景。方法用2 mol/L尿素溶解法,对50 000名广州血液中心无偿献血者中的Jk(a-b-)血型个体进行筛选。用传统的血型血清学方法对筛选到的Jk(a-b-)表型进行确证。随后从静脉血中提取DNA,PCR方法扩增Kidd血型系统编码基因Jk的所有编码外显子,并直接进行测序分析。结果在50 000名无偿献血者中共筛选到10名Jk(a-b-)血型个体,在广州地区无偿献血者人群中其分布频率约为0.02%。在对其中8名先证者基因分型中,共发现了2种基因型,纯合IVS5-1G>A(n=6),杂合IVS5-1G>A/杂合896G>A(299Gly>Glu)(n=2)。结论广州地区无偿献血者人群中,Jk(a-b-)的分布频率高于已报道的北方人群。高频率分布于太平洋波利尼西亚群岛的变异IVS5-1G>A,也是本人群中最常见的基因变异。

RhD变异型个体的表型类型和基因突变机制研究

目的:探讨RhD变异型个体的表型类型和基因突变机制。方法:收集2013年1月至2015年10月间经我中心用血清学方法确证的48例RhD变异型孕妇和献血者的血液标本,应用常规血清学方法进行Rh抗原分型后,提取血样DNA,用多重连接依赖探针扩增(multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)对入选的48例受检者的RHD进行检测,分析RHD的杂合性和外显子突变情况,并将MLPA检测结果与常规血清学结果进行对比。对比结果不一致的标本进行RHD外显子全长测序,并对其中新发现的等位基因进行克隆测序。结果:48例标本中,CcDee 20例(41.7%)、ccDEe 12例(25%)、CCDee 11例(22.9%)、CcDEe 5例(10.4%)。MLPA检出RHD单条等位基因突变(即杂合性为Dvd型)的38例,其中包含点突变18例、RHD/CE杂交替换20例;涉及两条等位基因突变(即杂合性为DvDv型)的10例,其中包含点突变合并RHD/CE杂交替换9例、碱基缺失合并RHD/CE杂交替换1例。MLPA能够明确其RhD变异型别的有41例(85.4%,41/48),包括弱D15型(845A)等位基因14例、RhDⅥtype 3等位基因22例;7例通过测序分析得以明确。发现2例新的等位基因,分别为79-81del CTC、689G>A。结论:CcDee是RhD变异型人群的主要表型,弱D15和RhDⅥtype 3是受检人群的主要RhD变异型,点突变和RHD/CE的杂交替换是主要的分子机制,79-81del CTC和689G>A为本研究发现的2个新等位基因。

广州地区汉族人群Diego血型系统多态性调查

目的了解广州地区汉族人群中Diego血型系统DI1(Dia)和DI2(Dib)、DI3(Wra)和DI4(Wrb)两对抗原的基因频率分布,为指导临床输血提供依据。方法随机收集广州地区献血者200名,从静脉血提取基因组DNA。采用红细胞血型系统多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术对DI1和DI2、DI3和DI4两对抗原进行基因分型。采用测序法对MLPA基因分型结果做进一步确认。结果广州地区汉族人群中DI1、DI2、DI3和DI4抗原的基因频率分别为0.040 0、0.960 0、0.000 0和1.000 0。MLPA基因分型结果与测序法分型结果完全一致。DI1和DI2、DI3和DI4抗原在广州地区汉族人群随机输血中抗原不配合率分别为3.84%和0.00%。结论 DI1和DI2抗原在广州地区汉族人群随机输血中不配合率较高,具有一定临床意义。通过MLPA方法可以对DI1和DI2抗原进行基因分型从而推测其表型,解决了因抗体来源困难导致抗原鉴定难以开展的难题。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型。方法采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析。结果在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型。其中,127名为RHD基因缺失(占63.5%);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4)-D)及弱D15型(RHD845A)等位基因。在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G>T,385Gly>Val)。结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测。也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源。

罕见p表型家系的分子遗传基础研究

目的研究1例广东籍罕见p表型的血清学特点及其家系的分子遗传基础。方法先用血清学方法鉴定p表型,再提取先证者及其家系成员的静脉血基因组DNA,采用PCR方法扩增α-1,4半乳糖基转移酶[α-（1,4）galactosyltrans-ferase,A4GALT]基因外显子3,并对扩增产物进行直接测序分析。结果先证者及其家系成员中有5人为p表型,A4GALT基因有纯合的点突变c.100G】A（p.34Val】Ile）及组合缺失插入突变c.418428ins-del（p.140fs,211X）;家系成员中只有1人为P2表型,携带有上述杂合突变。

Rh血型系统新生儿溶血病的实验诊断及特殊反应分析

目的探讨Rh血型系统新生儿溶血病的实验诊断和特殊试验结果分析。方法收集Rh系统新生儿溶血病标本12例,母血标本12例,测定其ABO和Rh血型。新生儿标本行溶血病3项实验,新生儿血清、放散液、母血清行不规则抗体筛选和鉴定实验,并测定相应抗体的效价。结果有1例患儿标本RhD血型放散前定型为阴性,放散后为阳性;患儿标本溶血病3项实验均阳性;引起溶血病的抗体中,IgG抗-D 9例,IgG抗-E检出2例,IgG抗-c合并抗-D1例;母血清中的IgG抗-D效价介于128~2048,IgG抗-E效价介于64~256;患儿血清中游离的IgG抗-D效价介于2~512,IgG抗-E效价介于4~32。结论直接抗人球蛋白实验和放散实验对于诊断Rh系统溶血病具有重要意义;特殊反应要综合分析处理,获取真实结果;临床输血或换血治疗时,要根据患儿体内的抗体情况进行血液选择。

高通量MLPA基因分型技术在1个D^(el)表型家系基因鉴定中的应用

目的对1个Del表型家系作基因鉴定。方法运用血型血清学方法对先证者及其家系的3名成员作RhD及相关血型抗原鉴定;提取先证者及其父母和妹妹的静脉血DNA。运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖探针扩增技术(MLPA)对先证者及其他成员血型基因作定性及定量分型;用PCR产物直接测序方法对发现的变异作确认。结果血型血清学检测:先证者为Del表型,其他3名家系成员为正常的RhD阳性个体。MLPA基因分型:先证者有2条包含1227G>A突变位点的RHD等位基因,而3名家系成员有1条包含1227G>A突变位点的RHD等位基因及1条正常的RHD等位基因。结论高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够对Del表型作明确的基因鉴定,有助于节约宝贵的RhD阴性血液。

疑难配血中混合抗体鉴定1例

目的探讨疑难配血过程中混合抗体的鉴定方法。方法首先鉴定红细胞血型,并对血清进行抗体筛查及鉴定,再利用特定细胞对患者血清进行吸收放散实验分离抗体,最后分别对分离后的抗体进行鉴定。结果患者血型为O型,Jka+b-,CCDee;用O型CCDee,Jkb+的细胞与患者血清进行吸收放散,分离抗体后鉴定结果为抗-cE、抗-Jkb的混合抗体。结论选择合适的细胞进行吸收放散实验分离抗体,可以实现对混合抗体的鉴定,为患者选择相应抗原阴性的血液,保证临床输血安全。

中国南方汉族人群特殊O型个体的血清学特征和分子背景

【目的】探讨特殊O型个体的血清学特征和分子背景。【方法】收集ABO正反定型结果不一致的O型标本12例,采用试管法进行正反定型、H抗原物质检测、吸收放散等实验;PCR扩增ABO基因编码区外显子1-7,并进行直接测序;对于新发现的突变位点进行克隆测序;利用PDBviewer软件构建GTB酶蛋白突变体的3D模型,并对突变引发的GTB酶结构和功能变化进行分析。【结果】12例标本正定型均为O型,反定型抗-A减弱的2例、完全消失的3例,抗-B减弱的5例、完全消失的2例;红细胞与抗-H的凝集强度均≥3+;所有标本均不能吸收放散抗-A和抗-B;等位基因ABO*O01、ABO*O02、ABO*O06、ABO*O13在该类人群中出现频率较高;发现2例Ael02/O02基因型的个体;1条等位基因所含c.563G>A(p.R188H)为新的突变位点,3D模型表明该突变位于GTB酶的底物结合区,突变引起R188的氢键数目减少。【结论】特殊O型的血清学特征以血浆中的单个抗体减弱或消失为主;ABO*O01、ABO*O02、ABO*O06、ABO*O13是这类血型个体的主要等位基因;新的等位基因ABO*O77可通过影响GTB酶的活性导致B抗原的生成缺失。