猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

利用腺病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的ORF2基因与T细胞表位(T cell epitope,TCE)基因,表达的融合蛋白具有反应原性,为研制PCV2新型疫苗奠定基础。以pMD18-T-ORF2、pMD18-T-TCE为模板,采用PCR方法扩增目的基因ORF2和TCE,以多肽接头(Gly4Ser)3为连接子,运用重叠延伸PCR技术将2段基因通过连接子(Gly4Ser)3进行融合连接。将融合基因定向克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV构建重组质粒pShuttle-CMVORF2-TCE,将该重组质粒用PmeⅠ酶线性化后电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞(内含pAdEasy-1骨架质粒)进行同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-ORF2-TCE。PacⅠ酶线性化pAd-ORF2-TCE质粒后转染AD293细胞包装病毒,重组腺病毒经3轮噬斑纯化后获得重组腺病毒rAd-ORF2-TCE,病毒滴度为1012.3 TCID50/mL。Western blotting及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorecent assay,IFA)结果表明融合蛋白得到正确表达。

犬防御素-3基因的真核表达及活性检测

为了在毕赤酵母X-33中表达犬防御素-3,并检测其抗菌活性,根据毕赤酵母密码子偏好性,人工合成犬防御素-3基因,构建重组质粒PpiczɑC-CBD-3,线性化后电转至毕赤酵母菌X-33,经抗性筛选,阳性克隆用10mL/L甲醇诱导表达,表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,并用琼脂空穴扩散法测定其抗菌活性。表达产物经Tricine-SDS-PAGE检测,在分子质量8.5ku左右有目的条带,与预期大小一致,表达的犬防御素经琼脂空穴扩散法检测显示出一定的抗菌活性。研究表明,犬防御素-3在毕赤酵母中成功分泌表达,为进一步研究奠定了基础。

数学课堂教学要重视学生非智力因素的培养

在数学课堂教学中学生能否发挥主体作用，常常受学生非智力因素的影响。不难发现，学生智力的差异并不悬殊，而导致课堂不和谐、学生学习成绩两极分化严重的原因，往往在于学生的学习动机、求知欲望、情感态度、学习意志等非智力因素的发展差异较大。因此，数学课堂教学中要重视学生非智力因素的培养。从以下几个方面可以有效地培养学生的非智力因素。

猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位重组腺病毒的免疫保护性研究

为了评估联合表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因和具有免疫原性的T细胞表位(T cell epitope,TCE)基因的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE的免疫保护效果,将20头抗体和核酸均为阴性的断奶仔猪随机分为4组,包括2组免疫组、攻毒对照组和阴性对照组。2组免疫组分别免疫重组腺病毒rAd-ORF2-TCE和rAd-ORF2,2周后加强免疫1次,一免后第28天攻毒。通过PCV2特异性抗体水平的检测以及血清中和试验评估疫苗的体液免疫反应水平,通过外周血T淋巴细胞亚群的动态变化以及细胞因子分泌水平评估疫苗免疫诱导的细胞免疫反应水平。结果表明,与其他对照组比较,重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够诱导猪体产生更为强大的体液免疫和细胞免疫水平。攻毒试验结果表明,rAd-ORF2-TCE能够有效抵抗PCV2感染。本试验结果进一步证实了构建的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够有效地诱导猪产生足够的免疫保护能力。