养殖牙鲆鱼苗腹水症病原菌的鉴定及系统发育学分析

从患腹水症养殖牙鲆鱼苗分离到一株细菌B1 7,人工感染实验证实其具有致病性。用Biolog GN细菌鉴定系统对B1 7进行测试 ,发现其与参考菌株的相似性较低 ,不能进行鉴定。常规生理生化测试表明 ,B1 7具有弧菌属的特征 ,其表型特征与Vibriosplendidus非常相似。为了进一步明确菌株B1 7的分类学地位 ,测定了其 1 6SrRNA基因序列 ,分析了相关细菌相应序列的同源性 ,构建了系统发生树 ,结果表明菌株B1 7与V .splendidus的亲缘关系最近。综合上述结果 ,菌株B1 7可鉴定为V .splendidus。

一株牙鲆皮肤溃烂症病原菌的鉴定

从山东荣成养鱼场发病牙鲆分离到一株病原菌M3 ,革兰氏阴性 ,杆状 ,能运动 ,菌落半透明 ,用BIOLOG细菌鉴定系统不能鉴定。通过 1 6SrDNA序列分析和同源性检索发现M3菌株与弧菌属的同源性较高 ,为 94%～ 98%。系统发育学分析表明菌株M3与鳗弧菌关系最近 ,相似性为 99 6 % ,其生化性状也和鳗弧菌的特征相似 ,故可把M3定为鳗弧菌 (Vibrioan guillarum)。

一株牙鲆出血症病原菌的分子生物学鉴定

从患出血症养殖牙鲆分离到一株病原菌M 4 ,革兰氏阴性 ,杆状 ,有极生和侧生鞭毛 ,能运动 ,菌落半透明。进行了常规生理生化和BIOLOG GN细菌鉴定系统测试 ,结果表明菌株M 4与V .carchariae的表型特征非常相似。为了进一步确定M 4的分类学地位 ,测定了其 16SrRNA基因序列 ,分析了相关细菌相应序列的同源性 ,构建了系统发生树 ,结果表明菌株M 4与V .carchariae的亲缘关系最近。综合上述结果 ,菌株M 4可鉴定为Vibirocarchariae。

虾池有机污染物降解细菌的筛选

在实验室条件下对 6 12株海洋细菌和 10株海水驯化淡水菌进行筛选 ,检测其快速降解水体中富营养有机物的能力。利用对虾饵料培养基、BOD仪、胞外酶检测等方法进行筛选 ,最后筛选到 10株对富营养有机物具有较高降解性能的细菌。所有的细菌均能产生明胶酶和脂酶 (Tween - 80 ) ,其中 9株细菌能产生淀粉酶 ,8株产生卵磷脂酶 ,2株产生酪蛋白酶 ,1株产生褐藻胶酶。通过测量BOD来衡量 10株细菌利用对虾饵料的效果 ,2天时能消化 46 .6 %～ 5 9.5 %的对虾饵料 ,5天时能消化 5 0 .8%～ 70 .2 %的对虾饵料。用常规生理生化方法将细菌鉴定到属 ,其中 3株为弧菌属细菌 (Vibriospp .) ,3株为假单胞菌属细菌 (Pseudomonasspp .) ,2株为发光杆菌属细菌 (Photobacteriumspp .) ,1株为气单胞菌属细菌 (Aeromonasspp .) ,1株为枯草杆菌 (Bacillussubtilis)。

弧菌拮抗菌的筛选

用平板划线或点种法对 6 0 2株海洋细菌进行筛选 ,得到 4株对海水养殖动物 (鱼、虾、贝 )的病原菌有拮抗作用的细菌。并对拮抗菌 QJ2的拮抗作用进行了研究 ,结果为 :QJ2有广泛的弧菌抗菌谱 ,对 37株弧菌的抗菌阳性率达到 89.2 % (33/ 37) ;用活菌平板计数法和 O.D.60 0 nm研究了QJ2培养物的去细胞上清液 (CFS)与病原菌 W- 1的作用动力学 ,15min时 W- 1的细菌数便开始减少 ,4 h时细菌数最少 ,6 h后开始增加 ,而对照组的细菌数呈逐渐上升趋势 ;QJ2对自身的拮抗物质不敏感 ;QJ2抗性物质的分子量不大于 80 0 0 Da;经常规生理生化方法和 API- 2 0细菌快速鉴定系统鉴定 ,QJ2为气味黄杆菌 (Flavobacterium odoratum)。

细菌糖蛋白对螯虾免疫因子的影响

实验检测了气味黄杆菌的胞外糖蛋白对克氏原螯虾（Ｐｒｏｃａｍｂａｒｕｓ ｃｌａｒｋｉｉ）的几种非特异性免疫困子一凝集素、酚氧化酶、溶菌、抗菌和超氧化物歧化酶等活力的影响。注射１０ ｍｇ糖蛋白后，实验组螯虾血清的免疫因子活力均高于对照组，凝集素活力在第１～４天最高；酚氧化酶在第１～５天维持较高活力，最大活力在第 ２天，溶菌、抗菌活力在第 １～ ６天维持较高水平，分别在第 ３天、第 ２天达到最大。与对照组相比，实验组螯虾肌肉的溶菌和抗菌、超氧化物歧化酶活力没有明显的变化。结果表明：气味黄杆菌的胞外糖蛋白可增强螯虾血淋巴的凝集素、酚氧化酶、溶菌和抗菌活力。

对虾WSSV人工感染螯虾及其检测

用对虾白斑综合症病毒(WSSV)人工感染淡水克氏原螯虾(Procambarusclarkii) ,感染组螯虾3～6d内全部死亡。核酸探针点杂交两次检测感染螯虾的鳃、胃、血淋巴 ,阳性检出率分别为92% (92% ) ,89 % (86 % ) ,81 % (75 % ) ,对照为11 % (3% ) ,5 % (5 % ) ,0(0) ;光镜下可观察到感染螯虾的胃、鳃组织的靶细胞核肿大、嗜酸性着染 ,电镜下病变组织细胞核可见形态大小与WSSV一致的病毒粒子 ;病毒核酸原位杂交两次检测感染螯虾的胃、鳃 ,阳性检出率均为100 % ,对照阳性检出率均为0。结果表明 :对虾WSSV可感染淡水克氏原螯虾 。

细菌QJ2对对虾病原性哈维氏弧菌的拮抗作用

对气味黄杆菌（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｏｒｄｏｒａｔｕｍ） ＱＪ２及其去细胞上清液（ＣＦＳ）对对虾病原性哈维氏弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｈａｒｖｅｙｉ）Ｚ３Ｇ２ Ｅ０２２的拮抗作用进行了研究。ＱＪ２的ＣＦＳ对病原菌表现显著的拮抗性能，在６ｈ内使数量为１０５－１０６ｃｆｕ·ｍＬ的病原菌（Ｚ３、Ｅ０２２均降为０。经热、酸碱、蛋白酶处理的ＣＦＳ，抑菌活性均有不同程度下降，结果为；经６０℃处理以６０ｍｉｎ的ＣＦＳ，经６ｈ使Ｚ３Ｇ２细菌数降为０，经１５ｍｉｎ使Ｅ０２２数量降为最低，为初始菌数的６３．０％：经１００℃处理１０ｍｉｎ，ＣＦＳ使Ｚ３Ｇ２和Ｅ０２２数量分别在１ｈ和１５ｍｉｎ降为最低，各为初始菌数的２３．７％和７２．１％；经ｐＨ４时作用３０ｍｉｎ，ＣＦＳ使Ｚ３Ｇ２和Ｅ０２２数量分别在１５ｍｉｎ和１ｈ降为最低，各为初始菌数的８８．３％和１５．９％，而经ｐＨ１２处理３０ｍｉｎ后，ＣＦＳ没有使病原菌数下降，但使病原菌以比对照组细菌低的速率缓慢上升；经蛋白酶Ｋ于３７℃作用６０ｍｉｎ后，ＣＦＳ在１５ｍｉｎ时使Ｚ３Ｇ２和Ｈ０２２数量降为最低，各为初始菌数的１５．０％和６６．１％。在人工水体中，ＱＪ２活菌对病原菌也具有显著的拮抗?

养殖牙鲆鳗弧菌疫苗的研究

以牙鲆病原性鳗弧菌M3为抗原 ,制备了细胞(CV)、细胞 胞外产物(CEV)、脂多糖(LPS)三种疫苗 ,通过浸泡和注射两种途径对牙鲆进行两次免疫 ,检测疫苗的免疫保护效果。免疫后4周可检测到免疫组牙鲆具有明显的凝集抗体效价 ,其中注射组效价显著高于浸泡组 ,而对照组变化不明显。与对照组相比 ,免疫组牙鲆获得良好的免疫保护力 ,其中注射免疫组高于浸泡组。在注射免疫途径中 ,以CEV的免疫保护效果最好 ;在浸泡免疫途径中 ,以CEV和LPS的免疫保护效果最好。结果表明鳗弧菌M3的细胞

大菱鲆出血症病原菌的分离和鉴定

从患病大菱鲆体内分离到一株病原菌SMP1，经人工感染试验计算出SMP1的半致死量LD50=1．94×10^6。药敏实验表明氟哌酸、丙氟哌酸、复合磺胺、氯霉素、四环素对SMP1有较强的抑制作用。BIOLOG细菌鉴定系统不能对SMP1鉴定。综合形态观察、生理生化特征、16S rDNA、溶血素基因保守区分析等实验结果，可将SMP1鉴定为鳗弧菌。

鳗弧菌胞外产物中致病因子的分离纯化及性质研究

鳗弧菌致病株M3的胞外产物经超滤、SephadexG10 0凝胶层析、DEAE cellulose离子交换层析和HPLC凝胶色谱层析纯化后 ,得到一个纯化的毒性蛋白酶 ,其对金鱼的半数致死量为 1 2微克蛋白 /克体重。该蛋白酶的分子量为 36 5kDa ,等电点为 5 1;与底物A zocasin作用的最适pH为 8 0 ,最适作用温度 5 5℃ ,85℃作用 30min后酶被灭活。该酶活性可被EDTA、EGTA及 1,10 菲咯啉抑制 ,表明它是金属蛋白酶。N端部分氨基酸序列经测定为AGATGTGPGGAGLTG。

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)亲虾繁殖期水体微生物多样性

为了揭示凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)繁殖期亲虾养殖水体的微生物多样性,我们比较了雌雄虾养殖水体细菌群落结构差异,采用Illumina HiSeq高通量测序方法对凡纳滨对虾亲虾养殖水体细菌的16S rRNA基因的两个高变区(V3-V4)进行测序分析,并进行了α-多样性指数和β-多样性指数分析。结果表明:雌雄虾养殖水体细菌群落的α-多样性指数中Chao1,ACE和Goods-coverage指数无显著差异(P>0.05),而Observed-species,Shannon和Simpson指数有显著性差异(P<0.05)。主坐标分析和聚类热图分析表明雌雄虾养殖水体的细菌群落结构不同,变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为两者共同的优势菌门,但其相对丰度有一定差异,在雄虾养殖池水体中相对丰度分别为76.15%和21.28%;在雌虾养殖池水体中相对丰度分别为66.01%和29.02%。两者的核心微生物群(属水平)明显不同,雄虾养殖水体的核心属主要包括Glaciecola、Octadecabacter、Methylobacterium、Psychroserpens、Olleya;雌虾养殖水体的核心属主要包括Pseudomonas、Polaribacter、Pseudoalteromonas、Vibrio、Arcobacter、Synechococcus、Hyphomonas、Paracoccus、HTCC、Thalassomonas、Thalassobius、Owenweeksia等,其中包括了Vibrio、Pseudomonas和Owenweeksia等病原相关菌类。该实验结果对凡纳滨对虾育苗阶段亲虾的健康管理、病害诊断及防治具有重要意义。

溶藻弧菌的PCR快速检测方法

为建立溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的PCR快速检测方法,本研究根据弧菌toxR基因的高变区序列设计1对扩增片段为161 bp的引物,进行了特异性和敏感性试验。结果表明该方法能特异地检测溶藻弧菌,每个PCR反应检测的敏感度为0.01 pg的DNA和3.7CFU的细菌。用溶藻弧菌人工感染大菱鲆,以建立的PCR方法检测感染鱼的肝、脾、肾阳性检出率为100%。该方法可用于对感染溶藻弧菌的水生动物疾病进行诊断。

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)M3菌株生长条件及其对蛋白酶产量的影响

采用体外测定细菌浓度、胞外产物 (ECP)蛋白含量和蛋白酶活力的方法 ,进行了鳗弧菌M3菌株在 2 2 16E培养基中的培养条件研究。结果表明 ,该菌株用固体培养基培养至 2 4h左右 ,可得到较高的菌体浓度、ECP蛋白含量和蛋白酶活力。采用响应面分析方法设计实验 ,用SAS统计软件分析数据 ,得到NaCl浓度、pH值和温度对菌体生长及蛋白酶产量影响的回归模型。在 2 2 16E培养基的基础上 ,添加不同氮源、碳源物质以及不同浓度蛋白胨进行生长研究。结果表明 ,胰大豆蛋白胨能促进菌体生长及ECP蛋白分泌 ;NH4 Cl与酪蛋白水解物可抑制蛋白酶的产生 ;牙鲆肌肉匀浆对菌体、ECP蛋白产量和蛋白酶产生有不同程度的促进作用 ;培养基中蛋白胨浓度为 4 %时菌体量与ECP蛋白含量达最高值 ,在蛋白胨浓度为 2 %时蛋白酶分泌量已稳定 ;1%的葡萄糖、蔗糖、甘油均能显著地提高菌体及ECP蛋白产量 ,却抑制了蛋白酶的产生。

鳗弧菌油乳化二价口服疫苗免疫养殖大菱鲆的免疫应答及免疫效果的研究

以鳗弧菌M3和SMP1为细菌抗原制备了油乳化二价疫苗,用饵料包埋后连续7天口服免疫大菱鲆鱼,评价鱼的免疫应答和疫苗的保护效果.结果显示,乳化疫苗在鱼后肠刺激产生的溶菌酶和抗蛋白酶活性以及抗体水平均高于未乳化疫苗（P＜0.05）;并且在乳化疫苗免疫的鱼血清检测到明显升高的M3抗体效价（P＜0.05）.原位杂交结果显示,乳化疫苗免疫鱼的后肠IgM的产生水平高于未乳化疫苗免疫鱼.攻毒实验显示,乳化疫苗免疫的鱼对M3和SMP1的感染分别获得100%和50%的免疫保护率,而未乳化疫苗获得的免疫保护率分别为57.9%和0%.结果表明,鳗弧菌油乳化二价口服疫苗能引起大菱鲆后肠的非特异性和特异性免疫应答并有效地抵抗鳗弧菌的感染,适合用作水产口服鱼用疫苗.

间接ELISA技术在病原性鳗弧菌SMP1快速检测中的应用

以大菱鲆(Scophthalmus maximus)出血症的病原菌——鳗弧菌(Vibrio anguillarum)SMP1为抗原,制备兔抗血清,测定了抗血清的工作浓度和对抗原的特异性,建立了在大菱鲆肝肾组织中检测SMP1的间接ELISA方法。SMP1人工感染大菱鲆,用建立的间接ELISA对大菱鲆肾脏和肝脏进行检测,结果肾脏的阳性检出率为87.7%,肝脏的阳性检出率为90%。该方法的建立有助于快速准确地鉴定由SMP1引起的大菱鲆疾病。

4株琼胶降解菌的分离、鉴定及产酶条件分析

从海藻及海参中分离筛选得到4株琼胶降解菌HD、JL、QJ和HS,均为革兰氏阴性菌,确定了它们发酵产酶的最佳条件均为:2216E海水培养基、初始Ph 7.5、琼胶底物浓度0.30%、培养温度28℃、培养时间36 h。大部分酶分泌到细菌细胞外。生理生化检测、16SrDNA序列同源性及聚类分析结果表明,HD、JL、HS为白色噬琼胶菌(Agarivorans albus);QJ的16SrDNA序列与Simiduia sp.,糖噬胞菌属(Sac charophagus sp.)和船蛆杆菌(Teredinibacter sp.)的相似性为93%～94%,在进化树上单独形成一个分支,但生理生化特征与它们有所不同,分类地位需要进一步确定。从HD、JL和HS中能克隆到β-琼胶酶基因,它们与其他物种的β-琼胶酶基因序列的相似性为97%～98%。

细菌毒力基因体内表达检测技术研究进展

病原菌入侵宿主是一个及其复杂的过程。为了深入了解病原菌的致病机理,人们需要鉴定那些在感染过程中特异表达的细菌毒力基因。为此,多种体内实验模型被建立起来分析细菌在宿主体内的基因表达,它们包括了体内表达技术、信号标签突变技术、差异荧光诱导、体外转座进行基因组分析和作图技术以及体内诱导抗原技术等。文章对目前运用的这些研究方法进展进行综述,并讨论了它们的优点与不足。