抗人CD3单抗轻、重链可变区基因的克隆及序列分析

根据抗体基因可变区两端保守序列ＦＲ１和ＦＲ４，设计并化学合成轻重链ＰＣＲ扩增引物。从体外培养细胞ＵＣＨＴ１中提取总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板经ＰＣＲ扩增轻，重链可变区基因片段。将扩增片段克隆至ｐＵＣ１９质粒，筛选阳性克隆并测序，序列分析结果为重链３６６ｐｂ，编码１２２个氨基酸，轻链３２７ｂｐ。

萧飒诗选

海岛之夜 雨和暮色一同从天涯落下， 大地暗如故乡。 在光芒中流浪的人啊，可以回来了 在那幸福的集合地，已经有人， 先于我们， 成为了我们。

抗人肺腺癌单克隆抗体重、轻链可变区基因的分离克隆和序列测定

根据鼠免疫球蛋白重。轻链可变区基因ＦＲ１和ＦＲ４的序列保守性，化学合成了适于体外扩增Ｉｇ重、轻链可变区基因（Ｖ_Ｈ和Ｖ_Ｌ）的数对引物。以分泌抗人肺腺癌单抗的杂交瘤细胞株ＷＬＡ－２Ｃ４的基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增Ｖ_Ｈ和Ｖ_Ｌ基因，分别克隆人ｐＵＣ１９载体。转化子经蓝、白斑筛选，酶切鉴定，双脱氧测序证实确为鼠单抗可变区基因，其中Ｖ_Ｈ基因全长为３４８ｂｐ，编码１１６ａａ，属重链ⅡＢ亚类；Ｖ_Ｌ基因全长３１８ｂｐ，编码１０６ａａ，属Ｋ轻链Ⅵ亚类。

新城疫病毒F蛋白纳米抗体的筛选及活性鉴定

旨在筛选新城疫病毒(NDV)F蛋白的纳米抗体,并对筛选的抗体活性进行初步鉴定。以NDV F蛋白中和表位构建诱饵,利用酵母双杂交技术对双峰驼天然重链抗体可变区(VHH)酵母双杂交文库进行筛选,获得4株VHH抗体序列。挑选其中2株最符合VHH特征的进行原核表达与纯化,并对2株VHH活性进行鉴定。ELISA结果显示,VHH1与VHH2与NDV病毒的反应性显著高于阴性对照(P<0.05),表明VHH与NDV病毒反应活性良好;Western blot结果显示,2株VHH可特异性识别F蛋白;细胞中和试验结果表明,2株VHH抗体均具有一定的中和活性。以上结果提示本研究成功筛选出2株活性较好的抗NDV F蛋白的VHH抗体,为VHH在NDV防控中的应用奠定了基础。

兽医教学中的生物安全问题及对策建议

生物安全问题是新世纪备受关注的重要的社会问题之一。兽医教学过程中经常会直接或间接接触到病原体,成为生物安全隐患较为集中的一个领域。为减少生物安全隐患对兽医教学带来的负面影响,该文就兽医教学过程中的生物安全隐患的主要存在环节、表现形式,以及目前兽医教学过程中的生物安全问题现状进行了分析,并为降低兽医教学过程中的生物安全风险提出了相应的对策建议。

浅析临沂市资源密集型产业的现状及其发展战略

随着社会经济的建设和发展，资源密集型产业在我国经济中的地位日益突出．同时它也出现了一些问题。这些问题能否得到妥善的解决关系到资源密集型产业持续健康的发展，也关系到我国经济发展的后劲，因此研究资源密集型产业发展战略愈显的重要。本文从经济学的原理入手分析其现状，包括其劣势及优势，然后提出相应的发战张略或途径。

长链非编码RNA——病毒与宿主相互作用中的新型调控因子

长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度>200 nt的非编码RNA,在多种生物学过程中发挥重要调控作用。近年来研究表明,lncRNAs可被病毒诱导表达,其作为一类新型的调控因子介导宿主与病毒相互作用,通过病原识别受体,以不同机制激活或抑制天然免疫应答反馈病毒感染。本文阐述了lncRNAs介导病毒与宿主相互作用中的调控机制,归纳了它们在宿主抗病毒天然免疫应答过程中的调控网络,以期为研究lncRNAs在抗病毒中的作用提供参考,为揭示病毒的致病机制和发现新的抗病毒靶标奠定基础。

大鼠细小病毒VP2原核表达及间接ELISA方法建立

本研究以大鼠细小病毒(Rat parvovirus,RPV)VP2基因的原核表达产物为抗原建立检测RPV抗体的间接ELISA方法。通过比对分析大鼠细小病毒不同毒株的VP2蛋白序列,我们筛选出了RPV株VP2蛋白上长度为378 bp的特异性成熟肽序列,随后构建了pET30a原核表达体系,借助His标签对重组表达产物进行纯化,以纯化鉴定后的表达产物为抗原,免疫Balb/c小鼠制备多抗血清并建立检测大鼠细小病毒血清抗体的间接VP2-ELISA方法。结果显示,抗原包被质量浓度为0.28μg/mL,阳性判定标准初步定为OD450≥0.5,与H-1株和KRV株的阳性血清存在一定的交叉反应,批内试验变异系数小于10%。本研究建立的RPV VP2-iELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于大鼠细小病毒感染的血清抗体检测。

新城疫病毒对水禽致病性的研究进展

新城疫(Newcastle disease,ND)是由ND病毒(NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性传染病。根据对鸡的致病力可将NDV分为3种不同类型,即速发型(强毒株)、中发型(中强毒株)和缓发型(弱毒或无毒株)[1]。家禽感染NDV以呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血、腺胃乳头出血和溃疡等为典型特征。过去人们普遍认为NDV可以感染水禽,但没有致病性。

基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

为制备基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)的单克隆抗体(MAb),本研究利用JS/17病毒株的HN重组蛋白和活病毒分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,并通过ELISA、间接免疫荧光和western blot方法筛选,制备了3株特异性识别HN蛋白的单克隆抗体(MAb)。其中,MAb1D4和4D9具有病毒中和活性(VN)及血凝抑制作用(HI),可以识别多种基因型的Ⅱ类NDV,但与Ⅰ类NDV病毒株无反应。MAb 2G8识别线性表位131DYIGGIGKE139,该表位在各病毒株中高度保守。获得的3株MAb可以用于NDV的鉴定及HN蛋白的功能研究。

鹌鹑源禽脑脊髓炎病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为探究陕西省咸阳市某鹌鹑养殖厂的鹌鹑发病是否为禽脑脊髓炎病毒引起,采集发病鹌鹑的脑、肝脏、肠道等组织,通过鸡胚传代、RT-PCR扩增、免疫组织化学试验及动物回归试验对病原体进行分离鉴定,并对得到的序列进行同源性及遗传性分析。RT-PCR扩增结果显示,用禽脑脊髓炎病毒(AEV)特异性引物成功扩增得到大小为288bp的目的片段,与参考株的核苷酸序列相似性及氨基酸序列相似性分别为84.9%~99.3%和95.8%~98.9%;遗传进化分析结果表明,分离株与SX株位于同一分支;免疫组化试验结果显示,发病鹌鹑的脑、肝脏、肠道组织切片中存在大量的阳性棕黄色着色区域,而阴性对照没有;动物回归试验结果显示,攻毒组鹌鹑出现典型的禽脑脊髓炎(AE)临床症状,发病率55.1%,病死率100%,病理剖检发现患病鹌鹑的脑组织软化,脑半球轮廓模糊,对照组未见异常。成功分离得到1株鹌鹑源禽脑脊髓炎病毒,命名为AEV XY/Q-1410株,为鹌鹑禽脑脊髓炎的诊断及预防提供理论与技术支持。

猪脑心肌炎病毒2A蛋白的原核表达与纯化

本试验对猪脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)2A蛋白进行原核表达和纯化。采用大肠杆菌原核表达系统,将EMCV 2A基因插入原核表达载体pET-28a-sumo中构建重组原核表达质粒pET28a-EMCV-2A,经PCR和测序鉴定无误。将重组原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,超声破碎后,2A蛋白的表达主要以包涵体形式存在。通过优化蛋白表达条件,使目的蛋白能够实现可溶性表达。利用磁珠纯化方法对重组蛋白进行纯化,并以SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,本试验成功构建2A的重组表达质粒;重组蛋白分子质量约为25 ku,与预期大小一致;IPTG浓度1.0 mmol/L、16℃低温诱导16 h为最佳诱导条件,约有50%的蛋白呈现可溶性表达;纯化后获得2A重组蛋白。本试验通过对EMCV 2A蛋白的原核表达及纯化,成功获得纯度较高的EMCV 2A蛋白,为进一步阐明EMCV的分子致病机制以及研发基因疫苗和抗病毒药物奠定基础。

类泛素化蛋白NEDD8单克隆抗体制备

利用RT-PCR从A549细胞中扩增出类泛素化蛋白编码的nedd8基因,将其克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,测序验证后转化入BL21(DE3)进行IPTG诱导,表达获得NEDD8蛋白,经纯化后,免疫接种6周龄BALB/c小鼠。细胞融合后,用ELISA和Western blot方法筛选单克隆抗体细胞株。结果成功制备获得3株单克隆抗体。免疫特异性鉴定结果表明,所得到的3株单抗适用于Co-IP试验,可以特异性检测NEDD8修饰的Cullin-1底物。通过分段表达鉴定单抗针对的抗原表位可能在29RVEE32氨基酸区域,与泛素化蛋白(Ub)无交叉反应。本研究制备的特异性单抗为进一步鉴定NEDDylation修饰底物提供了良好的抗体工具。

智慧城市建设应避免盲目性

智慧城市是把新一代信息技术充分运用在城市的各行各业之中的基于知识社会下代创新的城市信息化高级形态。智慧城市具有全面透彻的感知、宽带泛在的互联、智能融合的应用以及以人为本的可持续创新四大特征。这决定了智慧城市建设保障．

初冬大棚通风换气技巧

棚菜通风换气的目的是调节棚内的温度、湿度和二氧化碳的浓度以及排出有害气体。农民朋友在实际生产和操作过程中．应注意以下原则和措施。

准备创业就要学会“倒着走路”

面对资金和市场,创业者应该先抓哪个？按常理,大部分创业者会选择先找资金,再去找市场。创业者不妨学学＂倒着走路＂,先从市场终端寻找合适的项目,再考虑创业的资金来源。

抗人膀胱癌单克隆抗体重、轻链可变区基因体外扩增、克隆及序列分析

应用人工合成的两套引物，从分泌抗人膀胱癌特异性单抗的杂交瘤细胞ＢＤＩ－１中提取总ＤＮＡ。以之作模板，经ＰＣＲ法扩增出重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ＰＵＣ１９质粒，筛选出阳性克隆，用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。结果表明：重链可变区基因全长３６６ｂｐ，编码１２２个氨基酸，属于小鼠重链可变区的ＳｕｂｇｒｏｕｐＩＩ，由种系基因中的ＶＨ与Ｄ基因的Ｄｓｐ２．２及ＪＨ４基因重排而成；轻链可变区基因全长３２４ｂｐ，编码１０８个氨基酸，属于小鼠轻链可变区的ＳｕｂｇｒｏｕｐＩＶ，由种系基因中的Ｖκ与Ｊκ４基因重排而成。与已发表的抗体可变区基因序列比较。

抗人CD3单链抗体与改形单域抗体的表达

设计并化学合成含有适当酶切位点及连接肽的寡核苷酸序列,与一定的背景载体连接并改造成适用于单链抗体表达的载体:外分泌型pWAI80和融合蛋白型pROH80从分泌抗人CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞UCHT1中,经PCR扩增出轻、重链可变区基因V_H和V_K,并插入上述表达载体中构建成单链抗体基因.通过对鼠OKT3结合位点的结构模拟,并比较人、鼠抗体家族性保守序列,设计出改形OKT3的基因序列.化学法部分合成8个寡核苷酸片段,应用重叠PCR技术扩增出完整改形重链基因V_H,并克隆、酶切和测序鉴定.将所克隆V_H基因插入表达载体pCOMB3和 pGEX-4T-1中进行表达.经 IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和 Western blot分析以及 ELISA检测,结果发现分泌型表达产物及 M13基因Ⅲ-V_H改形单域抗体融合蛋白具有与CD3单抗竞争抑制的活性;而融合型单链抗体及改形单域抗体表达产物主要以包涵体形式存在,占细菌总蛋白的 30％左右.

2株蛋鸡源基因Ⅸ型新城疫病毒全基因序列测定及遗传进化分析

为分析鸡源基因Ⅸ型新城疫病毒的分子特征及遗传进化关系,对两株蛋鸡源NDV进行部分生物学特性测定及全基因测序分析。参考基因Ⅸ型NDV毒株的序列设计10对引物,采用RT-PCR的方法对NDV分离株Layer/China/Yulin/10和Layer/China/Changan/10分段进行扩增及测序,拼接获得全基因序列。结果表明,2株病毒的MDT分别为37.2和56.5h,ICPI分别为1.838和1.603,F基因的裂解位点序列均为112 R-R-Q-R-R-F117,HN基因均编码571个氨基酸,均符合NDV强毒株的特征;2株病毒的基因组全长均为15 192bp,同源性高达99.9%;F基因和全基因系统进化树显示2株NDV均属于ClassⅡ中的基因Ⅸ型,和其他基因Ⅸ型和基因Ⅲ型毒株的亲缘性较高,与野鸟源NDV同源性为99.9%,遗传距离为0.001 1,以上结果表明,这两株鸡源NDV与野鸟源NDV的亲缘关系较近。提示野鸟可能在基因Ⅸ型NDV的扩散与传播中有重要的作用。

抗膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因扩增克隆及序列测定

从分泌人膀胱癌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞ＢＤＩ－１中提取总ＤＮＡ，应用人工合成的引物经聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出重链可变区基因片段，将扩增产物插入ＰＵＣ１９质粒，筛选出阳性克隆，用链终止法进行ＤＮＡ序列测定分析。结果证实抗体重链可变区基因片段全长由３６６个碱基组成。