鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA)检测方法的建立及应用

为建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的实时荧光重组酶辅助扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法,根据AngHV的ORF 95基因序列设计引物和探针,优化反应温度,确定反应时间,并应用该方法对采集的临床样品进行检测。结果表明:本研究中建立的实时荧光RAA检测方法的最佳反应温度为39℃,反应时间为20 min;实时荧光RAA检测方法的灵敏度、特异性及重复性评价显示,RAA检测AngHV的最低检测量为1×10^(2)copies/μL,可特异性地检测AngHV,与美洲鳗鲡腺瘤病毒(American eel adomavirus,AEAdoV)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)、鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)和对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)均无交叉反应;实时荧光RAA检测方法的组内和组间变异系数均小于5%,表明实时荧光RAA检测方法灵敏度高、特异性强和重复性好;应用该方法对采集的25份临床样品进行检测显示,实时荧光RAA检测方法与qPCR方法的检出率一致,均为92%,高于普通PCR的检出率(76%)。研究表明,本研究中所建立的鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增RAA检测方法快速、灵敏、可靠、准确,可用于AngHV的临床快速检测和流行病学调查。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

美洲鳗鲡“脱黏败血综合征”病原的分离鉴定及其致病性研究

为明确美洲鳗鲡“脱黏败血综合征”的病原,本研究采集福建省某养殖场的美洲鳗鲡病料组织样品制备病理切片,观察各组织病变,结果显示,病鳗的鳃、肝脏和肾脏呈现广泛性红细胞渗出和组织细胞变性、坏死。将病料样品接种鳗鲡肾脏细胞系(EK)进行病毒的分离,对分离病毒经电镜观察,结果显示,接种病料样品匀浆液的EK细胞出现合胞体病变,可见细胞核内有大量直径约120 nm的病毒。提取病毒基因后作为模板,采用PCR鉴定,结果证实其为鳗鲡疱疹病毒(AngHV),将其命名为AngHV-20713。进一步扩增分离病毒的ORF71基因并分析其同源性和遗传进化关系,结果显示,AngHV-20713与其它AngHV的同源性为93.6%~99.0%,且与分离自美洲鳗鲡的AngHV亲缘关系最近。将分离病毒以106 pfu/尾腹腔注射健康的美洲鳗鲡和欧洲鳗鲡,进行人工感染实验,结果显示,AngHV-20713对鳗鲡具有致病性,感染鳗鲡可见体表黏液脱落、胸鳍出血等“脱黏败血综合征”症状,并导致美洲鳗鲡60%的发病率和20%的死亡率,而感染的欧洲鳗鲡死亡率高达56.7%。利用qPCR从感染病毒的美洲鳗鲡各组织内均可检测到AngHV,从内脏可再次分离培养到AngHV-20713,表明AngHV是美洲鳗鲡“脱黏败血综合征”的病原。本研究为深入开展鳗鲡“脱黏败血综合征”的防控研究奠定了基础。

鳗鲡疱疹病毒ORF115基因克隆、转录时相分析及原核表达

【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF115基因,获得ORF115基因序列生物信息学特征,分析其在病毒入侵细胞过程中的转录时相并进行原核表达,为解析ORF115基因的特性和功能及开发免疫学诊断技术和亚单位疫苗打下基础。【方法】根据GenBank已公布AngHV参考株(NC_013668)的基因序列,设计特异性引物扩增ORF115基因,从分离的AngHV-FJ福建株(AngHV-FJ)基因组中扩增出ORF115基因,克隆至pMD19-T载体,经酶切鉴定和测序验证,获得ORF115基因序列。采用Softberry、ProtParam、TMHMM、SignalP 5.0、PSORTⅡ及BepiPred等在线软件进行生物信息学分析;采用反转录PCR(RT-PCR)对ORF115基因进行转录时相分析;将ORF115基因克隆至表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测及Western blotting鉴定。【结果】克隆获得的AngHV-FJ ORF115基因全长318 bp,与GenBank已发布的参考序列相似性为100%;生物信息学预测表明,AngHV-FJ ORF115基因编码蛋白的分子量为11.8 kD,理论等电点(p I)为6.04,不稳定系数为16.38,总平均亲水性指数为0.172,属酸性弱疏水蛋白,较稳定;OR115蛋白存在跨膜结构,无信号肽,主要分布于细胞质中,有长片段抗原表位;转录时相分析结果表明,ORF115基因的转录本在病毒感染细胞后6 h即可检出,于感染24 h达峰值,随后无明显变化,属于病毒晚期基因。SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示,ORF115基因可在大肠杆菌中表达,表达蛋白大小与预期一致,约32 kD。【结论】AngHV ORF115基因属于病毒晚期基因,其编码蛋白属酸性弱疏水蛋白,有长片段抗原表位,可能在病毒感染晚期发挥作用。获得的ORF115原核表达蛋白可用于制备多克隆抗体及AngHV亚单位疫苗开发。

不同含水率的餐厨垃圾对黑水虻幼虫生长发育的影响

近年来,利用黑水虻幼虫转化餐厨垃圾生产高质量动物蛋白已经成为餐厨垃圾处理的一个重要途径.为了研究不同含水率餐厨垃圾对黑水虻幼虫生长发育的影响,本研究选择黑水虻6日龄幼虫进行试验,餐厨垃圾二相分离处理后,用蒸馏水调控其含水率,分别在含水率50%、60%、70%条件下养殖黑水虻,以麦麸为对照,比较不同处理条件下黑水虻幼虫的体重、体长和体宽的变化及幼虫化蛹率、蛹羽化率;同时,观察餐厨垃圾和麦麸饲养下黑水虻幼虫及饲料的变化.结果发现,含水率为60%的餐厨垃圾饲养下的黑水虻幼虫体重、体长和体宽高于含水率50%处理组,并显著高于70%处理组(P<0.05);而含水率为70%的麦麸则优于含水率50%和60%处理组;分别以含水率60%的餐厨垃圾和含水率70%的麦麸饲养黑水虻,餐厨垃圾和麦麸均能被黑水虻幼虫有效利用,且生长发育良好.研究结果为深入开展大规模利用黑水虻幼虫处理餐厨垃圾提供重要的参考依据.

微生物肥料效应及其应用展望

简述了微生物肥料种类、特点及其生理生态效应,指出应加强微生物肥料基础与应用研究,并展望微生物肥料发展前景。

鳗鲡疱疹病毒的分离与鉴定

为获知鳗鲡"脱粘败血病"与病毒的关系,实验用蔗糖密度梯度离心的方法从发病的欧洲鳗鲡内脏器官组织匀浆液中纯化了病毒粒子,负染后利用电镜观察;进一步用EO细胞对病毒进行了分离、培养,并对感染病毒的细胞进行超薄切片,电镜观察;然后,提取病毒DNA,利用鳗鲡疱疹病毒的PCR检测方法对其进行了鉴定。结果显示,接种匀浆上清液的EO细胞出现细胞融合的病变效应;分离病毒的病毒粒子具囊膜,大小约为200 nm;从感染病毒的细胞上清液DNA中扩增出特异性条带,序列测定与比对分析表明,该序列与鳗鲡疱疹病毒欧洲株(AngHV-1)的序列完全一致。研究表明,利用EO细胞分离了一株鳗鲡病毒,经形态观察和DNA分析,确认该病毒为鳗鲡疱疹病毒,命名为AngHV-FJ。该研究为深入开展鳗鲡疱疹病毒的致病机制及鳗鲡"脱粘败血病"的防控研究奠定了重要基础。

限根程度对黄瓜生长及光合特性的影响

研究了根域体积限制对日光温室基质栽培黄瓜生长及光合特性的影响。结果表明,根域体积的限制使黄瓜生长量明显降低,植株的根冠比明显提高,叶片的光合功能明显下降。限根反应时间与栽培时期及限根程度有关,春茬12L、8L、4L处理黄瓜的限根反应时间分别为定植后49d、64d、79d,秋冬茬黄瓜的限根反应时间则分别提前了15d。春茬黄瓜4L处理的产量显著低于其它处理,秋冬茬黄瓜的产量处理间无显著差异;因此,可用8L的根域体积进行春茬黄瓜的早熟栽培(80d左右生育期),4L的根域体积进行秋冬茬黄瓜栽培。

鳗鲡病毒性疾病病料中鳗鲡疱疹病毒的PCR检测

结合流行病学、临床症状、病理变化等对2006～2012年收集的发病濒死鳗鲡病料进行分类,确定疑似鳗鲡病毒性疾病病料36份,提取病料主要内脏器官(肝、脾、肾)DNA,进行鳗鲡疱疹病毒的PCR检测。从"脱粘败血病"、"红头病"、"烂鳃病"的鳗鲡病料中检测到6份阳性结果,表明这些疾病可能是由鳗鲡疱疹病毒引起的。DNA测序结果显示,扩增的病毒DNA聚合酶基因片段与分离自台湾、日本及欧洲的病毒株完全一致,表明这些病毒可能为同一病毒株。

VAM对植物矿质营养的效应

本文综合大量研究资料论述了VAM对植物吸收P、N、S、B、K、Ca、Mg、Na、Zn、Cu、Mn、Fe、Al、Si等矿质元素的影响,并对VAM在减轻或避免重金属毒害等方面的作用进行探讨。

丛枝菌根(AM)及其在园艺作物上的应用

综述了国内外园艺作物丛枝菌根的研究进展情况 ,影响丛枝菌根形成和发育的生态条件及园艺作物的生理生态效应 ;讨论了丛枝菌根在园艺作物上的应用意义及潜力 ,并提出了丛枝菌根实际应用所需要解决的问题。

水生动物双RNA病毒的研究进展

水生动物双RNA病毒(Aquabirnavirus,ABV)隶属双RNA病毒科Birnaviridae,是一类可引起水生动物爆发传染性病毒病的病原,在世界范围内给水产养殖业造成了巨大损失,其代表种为传染性胰脏坏死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus,IPNV)。ABV的基因组包括两段分节的RNA,以负链RNA为模板进行病毒基因组复制,编码5种成熟的蛋白;本文结合ABV的功能基因、致病机理、诊断检测及免疫防治等近年研究的热点做一综述,以期为研究者提供参考。

冬季田间冻害胁迫对露地越冬甘蓝膜系统的影响

观测冻害对露地越冬栽培甘蓝膜系统的影响结果表明,生长季内叶片电解质渗漏率、丙二醛(MDA)含量随温度下降而增加,抗冻性差的“8398”、“8132”甘蓝品种在1月份冻害温度下电解质渗漏率>50％,膜系统受伤害较重,酶促保护系统关键酶超氧化物歧化酶(SOD)活性急剧下降,过氧化物酶(POD)活性上升。露地越冬甘蓝专用品种“冬冠1号”在1月份冻害温度下电解质渗漏率、MDA含量较低,SOD仍保持较高活性,表现出较强抗冻性。

草地贪夜蛾两种重要卵寄生蜂的鉴别及寄生行为

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)是世界重要农业害虫,具有很强的迁飞性,对玉米等禾本科植物造成危害。调查草地贪夜蛾卵寄生性天敌资源,明确其种类和鉴别特征,对筛选优势天敌种类和开展生物防治具有重要意义。对福建省寄生性天敌资源调查结果表明,福建省有两种草地贪夜蛾卵寄生蜂,分别为夜蛾黑卵蜂Telenomus remus Nixon和螟黄赤眼蜂Trichogramma chilonis Ishii,本文记述了这两种卵寄生蜂的主要形态特征,并观察了其寄生行为。

柑橘木虱寄生性天敌调查及一新种记述

柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama既是柑橘上的重要害虫,又是柑橘黄龙病的传播虫媒,对我国柑橘产业存在潜在威胁。进一步调查柑橘木虱的寄生性天敌资源,明确其种类和鉴别特征,对筛选优势天敌种类并开展生物防治应用具有重要意义。本文调查结果有柑橘木虱初寄生蜂2种,分别为亮腹姬小蜂Tamarixia radiate(Waterston)、阿里食虱跳小蜂Diaphorencyrtus aligarhensis(Shafee, Alam et Argarwal);重寄生蜂4种,分别为新种小斑塔姬小蜂TamarixiamicromaculaWangetHuang,sp.n.(姬小蜂科Eulophidae)、沃氏卡棒小蜂Chartocerus walkeri Hayat、黄食虱跳小蜂Psyllaphycusdiaphorinae Hayat(中国新记录属、新记录种)、恩蚜小蜂Encarsiasp.♂。记述了寄生性天敌分类鉴别的主要形态特征及其发生概况,描述了新种小斑塔姬小蜂,提供了寄生性天敌的形态特征照片。新种模式标本及其他研究标本保存于福建农林大学植物保护学院。

鳗鲡疱疹病毒ORF95基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

鳗鲡疱疹病毒(Anguillae herpesvirus,AngHV)是淡水鳗鲡的主要病毒性疾病病原之一。根据鳗鲡疱疹病毒(AngHV-1)的基因组序列(GenBank:NC-013668)设计引物,扩增鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF95基因的开放阅读框序列,克隆至pMD19-T载体;经限制性内切酶酶切和测序鉴定,进一步将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建了表达质粒32a-ORF95,将其转化表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导,实现了ORF95在大肠杆菌中的高效表达。在0.1mmol.L-1 IPTG、23℃诱导14h的条件下,可溶性ORF95蛋白的表达量较高,经镍柱纯化获得了高纯度的融合蛋白。

鳗鲡疱疹病毒ORF51基因的原核表达及多克隆抗体的制备

将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.

鳗鲡疱疹病毒ORF8基因的克隆表达及转录时相分析

为研究鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF8基因的特性,根据GenBank中AngHV参考株(NC_013668)的ORF8序列设计引物,采取PCR方法从分离的AngHV福建病毒株(AngHV-FJ)基因组中扩增出特异性片段,克隆至pMD19-T载体,经酶切和测序验证,获得了ORF8的基因序列。结果表明:经生物信息学分析,ORF8编码的蛋白稳定性较好,存在跨膜结构且抗原表位多,符合病毒囊膜蛋白的特征;经转录时相分析,ORF8是病毒的早期基因(early gene,E),可能在病毒感染的早期阶段就发挥作用;将ORF8克隆至表达载体pET-32a,转化入大肠杆菌E.coli BL21中,以IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE及Western blot检验,实现了ORF8在大肠杆菌中的高效表达,进一步通过割胶的方法获得了相对分子质量约为44000的高纯度融合表达蛋白。本研究为下一步评价该表达蛋白的免疫效果和制备抗体,以及开发免疫诊断试剂和疫苗提供了研究基础。

鳗鲡疱疹病毒FJ株ORF51基因的克隆及生物信息学分析

为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF51的结构特征,扩繁了AngHV-FJ,提取其基因组DNA,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功能。结果显示,扩增到长约720bp的ORF51基因序列,其与GeneBank上鳗鲡疱疹病毒欧洲株(AngHV-1)ORF51基因的序列完全一致。该基因编码239个氨基酸;预测ORF51基因编码蛋白的分子量为26 107.1Da,等电点为7.66,是疏水性蛋白且偏碱性;有4个跨膜域;抗原表位预测显示抗原性较好;结构预测显示,存在1个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、10个磷酸化位点;亚细胞定位预测显示其主要存在于内质网。本研究为解析ORF51的功能及开展AngHV的基因工程疫苗研究奠定了基础。

斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达

【目的】实现斑马鱼g型溶菌酶在大肠杆菌中表达,以获得高纯度且具溶菌活性的融合蛋白,为探究g型溶菌酶在斑马鱼抗菌过程中的作用机制及其开发利用打下基础。【方法】通过ClustalW、ExPASy、SignalP-5.0 Server及PSIPRED等在线软件对斑马鱼g型溶菌酶进行生物信息分析,经密码子优化后合成斑马鱼g型溶菌酶基因,亚克隆至pET-28a(+)表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG进行诱导表达,并通过非干扰型蛋白浓度测定试剂盒和溶菌酶测定试剂盒(比浊法)测定其浓度及溶菌活性。【结果】从GenBank检索获得的斑马鱼溶菌酶基因g1(NM_001002706.1)和g2(XM_002664371.5)分别命名为Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。Zeb-Lys-g1基因开放阅读框(ORF)长591 bp,共编码196个氨基酸残基,其编码蛋白分子量约21.6 kD;Zeb-Lys-g2的ORF长576 bp,共编码191个氨基酸残基,其编码蛋白分子量约21.1 kD;2种斑马鱼g型溶菌酶序列中均含有2个半胱氨酸残基及3个保守的催化残基位点(Glu、Asp和Asp)。Zeb-Lys-g1的N端含有17个氨基酸的信号肽,而Zeb-Lys-g2不存在典型的信号肽结构,但其三级结构均具有多个α-螺旋结构。在基于溶菌酶序列相似性构建的系统发育进化树中,Zeb-Lys-g1序列与金鱼g型溶菌酶序列的亲缘关系最近,而Zeb-Lys-g2序列与鲈形目和鲽形目鱼类的g型溶菌酶序列亲缘关系较近。将合成的斑马鱼g型溶菌酶基因(Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2)亚克隆至pET-28a(+)表达载体并转化BL21(DE3)感受态细胞,20℃下经IPTG(终浓度0.5 mmol/L)诱导16 h,可获得融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2,纯化后的浓度分别为1.01和1.66 mg/mL,对应的溶菌活性分别为689.68和44.39 U/mg。【结论】鱼类g型溶菌酶的基因变异较保守,经密码子优化及全基因合成方式合成的斑马鱼g型溶菌酶基因Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2可通过原核表达获得高纯度、高溶菌活性的融合蛋白,为探究斑马鱼溶菌酶的抗菌机制提供了技术支持。