绵羊肺炎支原体GH3-3株全基因组测序及生物信息学分析

【目的】全面了解绵羊肺炎支原体GH3-3株的基因序列,研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制。【方法】采用体外培养,利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组DNA,进行全基因组测序。【结果】绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组大小为1060772 bp,GC含量为29.66%,基因组组分分析后发现,GH3-3株的基因组含有730个编码基因,总长度为914379 bp,平均长度为1252.57 bp,占基因组全长的86.2%。串联重复序列共149个,总长为20926 bp,占基因组全长的1.97%。微卫星DNA序列102个,tRNA 30个,rRNA 3个。在NR、SwissProt、GOG、KEGG、GO、CARD、CAZy、PHI、TCDB、RMS数据库中,分别有719、459、473、394、449、33、5、180、113、59个基因被注释;在VFDB数据库中,共注释到了76个毒力因子相关的基因。将基因组序列提交至NCBI网站,获得登录号为:PRJNA1051969。【结论】获得了绵羊肺炎支原体GH3-3株完整的基因组信息,预测和注释了其基因的功能,明确了GH3-3株以及与国内外其他绵羊肺炎支原体菌株之间的遗传进化关系。

RaeR对鸭疫里默氏杆菌外排泵RaeC-RaeA-RaeB的调控作用研究

旨在阐明鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株GE 296_RS05175基因编码的RaeR对外排泵RaeC-RaeA-RaeB的调控作用。构建RA-LZ01株的GE296_RS05160基因(编码内膜蛋白RaeB)缺失株ΔRaeB和回复株cΔRaeB,以及GE296_RS05175基因缺失株ΔRaeR和回复株cΔRaeR。测定菌株的生长曲线、菌株对抗菌素的敏感性以及GE296_RS05160和GE296_RS05175基因在特异性底物刺激下的转录水平。结果显示,与亲本株相比,缺失株的生长能力无明显变化;与亲本株和回复株相比,缺失株ΔRaeB对卡那霉素、链霉素和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)的敏感性上升,而缺失株ΔRaeR对卡那霉素、链霉素和SDS的敏感性降低;加入SDS刺激后,RA-LZ01和ΔRaeR株的GE296_RS05160基因的相对转录水平分别上升了2.26倍和4.64倍,ΔRaeR株中该基因的上调倍数明显超过了RA-LZ01株;在SDS刺激下,RA-LZ01和ΔRaeB株的GE296_RS05175基因的相对转录水平均明显下调。上述结果表明,外排泵RaeC-RaeA-RaeB与菌株的生长无明显相关性,可介导菌株对卡那霉素、链霉素和SDS产生耐受;底物SDS可刺激GE296_RS05175基因的转录水平降低,该基因编码的RaeR对RaeB的表达发挥负向调控作用。

鸭脑微血管内皮细胞培养鉴定及其永生化细胞系的建立

本研究旨在获得高纯度鸭脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells,BMECs),并建立其永生化细胞系,为研究鸭疫里默氏杆菌的致病机制提供重要的试验材料。通过胰蛋白酶消化的方法成功分离出樱桃谷鸭原代BMECs,通过猿猴病毒40(Simian virus 40,SV40)转染的方法,转染后连续传12代获得樱桃谷鸭BMECs永生化细胞系。对BMECs的细胞核以及内皮细胞的标志性蛋白血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)进行免疫荧光染色观察,对原代细胞和永生化细胞系进行鉴定。结果显示,成功从樱桃谷鸭脑组织中分离出BMECs并传代培养,经慢病毒转染后体外传代培养12代以上,细胞仍稳定表达vWF,成功建立了樱桃谷鸭BMECs永生化细胞系。

绵羊肺炎支原体荚膜多糖的提取纯化及反应原性分析

本研究旨在提取绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)GH3-3的荚膜多糖,并验证其反应原性。用无水乙醇沉淀得到粗荚膜多糖,再通过苯酚抽提、酶处理去除核酸和蛋白质,进而纯化得到荚膜多糖,利用免疫荧光试验证明该荚膜多糖的反应原性,利用刚果红试验检测其是否具有三螺旋结构。从1 L培养基上清中初步提取得到Mo GH3-3粗荚膜多糖12.24 mg,经过纯化得到9.8 mg的精制荚膜多糖,其纯化得率约为80%。免疫荧光试验结果表明Mo GH3-3荚膜多糖具有良好的反应原性,刚果红试验首次证明绵羊肺炎支原体荚膜多糖具有三螺旋结构。经过乙醇沉淀、苯酚抽提、酶处理、超滤浓缩后,得到高纯度的Mo GH3-3荚膜多糖。该提取纯化方法简便、成本低,便于生产实践中应用。荚膜多糖具有反应原性和三螺旋结构,证明其生物活性良好,为相关诊断试剂、疫苗、佐剂等的研发提供了可参考的多糖制备方法。

基于可见光测定的山羊支原体山羊肺炎亚种抗原定量

山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)是山羊传染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)的病原,可用灭活疫苗和荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)间接血凝试剂进行预防和血清学检测,但高昂的培养成本和复杂的抗原定量一直困扰着生产人员。为解决生产实际中出现的这些问题,本研究基于Mccp代谢组学的前期理论基础,通过改变初始pH值的方法,初步筛选出初始p H值为7.8的可以同时提高2种抗原产量的糖发酵培养基。利用紫外可吸收光谱可识别酚红,以及十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)可与阴离子荚膜多糖结合的理论依据,建立了利用紫外光谱分析Mccp达到的培养阶段,以及利用CTAB沉淀法相对定量发酵液荚膜多糖抗原产量的方法。通过紫外图谱观察的方法可对应Mccp生长曲线进行指导生产,大大节省传统颜色变化单位(color change unit,CCU)法的监测时间,提高了原肉眼观察方法的精确度。建立的CTAB沉淀法可在5 h内完成对CPS含量的监测,与传统的差值法相比大大缩短了时间,并且其准确度得到苯酚-硫酸法的验证。本研究优化的一种培养基和建立的两种相关性比较方法,可有效降低Mccp生产成本,提高生产效率,这些方法已在本实验室的研究阶段得到应用,为进一步改进CCPP灭活疫苗和荚膜多糖的生产工艺以及快速定量提供了实验数据。

绵羊肺炎支原体特异性诊断靶标筛选及其间接ELISA方法的建立

本研究旨在筛选出绵羊肺炎支原体(Mo)特异性抗原靶标,并建立间接ELISA方法。利用Pulldown实验结合LC-MS技术分析,筛选Mo的抗原靶标并进行表达纯化,使用Western-blot试验分析纯化蛋白的反应原性;免疫小鼠,分析蛋白免疫原性、制备免疫血清,建立基于靶标蛋白的间接ELISA方法,并对其进行性能评价。结果显示,筛选出的Mo pdhD蛋白的分子质量为71 ku,该蛋白与稀释度为1∶4000的Mo阳性血清仍可以发生反应,免疫小鼠血清效价可达1∶102400,建立的间接ELISA方法不与绵羊痘病例等的阳性血清产生交叉反应,批间及批内重复的变异系数均在12%以内,与IHA法符合率可达82.5%。可见,Mo pdhD蛋白具有良好的反应原性与免疫原性,建立的间接ELISA方法性能良好,可用于Mo的血清学诊断,为进一步研发Mo ELISA抗体检测试剂盒奠定了基础。