丙氨酸抑制PKM2表达对缺血性脑损伤保护作用

目的研究丙氨酸(Ala)在缺血性脑损伤中的神经保护作用以及Ala对M2型丙酮酸激酶(PKM2)表达水平的调节。方法体外培养原代神经元并构建氧-糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型,将神经元随机分为对照组、OGD/R模型组以及OGD/R后Ala干预组(OGD/R+Ala),应用CCK-8方法检测Ala干预对神经元存活率的影响,Western blot方法检测Ala对OGD/R模型神经元内PKM2蛋白表达水平的影响。构建大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,随机将36只SD大鼠分为假手术组、MCAO组以及MCAO后Ala干预组(MCAO+Ala),每组12只,采用免疫荧光方法检测脑缺血/再灌注损伤后神经元内Ala含量的变化,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察各组脑梗死面积,Western blot方法检测Ala干预对缺血损伤脑组织中PKM2蛋白表达水平的影响。结果CCK-8与Western blot检测结果显示,各组神经元存活率及PKM2蛋白表达差异有显著性(F=86.88、20.83,P<0.05),OGD/R组细胞存活率较对照组显著降低,PKM2蛋白表达较对照组升高(t_(LSD)=4.65、10.95,P<0.05);OGD/R+Ala组细胞存活率较OGD/R组显著增加,PKM2蛋白表达较OGD/R组明显下降(t_(LSD)=4.98、4.69,P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,MCAO组大鼠受损神经元内Ala含量较假手术组明显降低。TTC结果显示,Ala干预使MCAO模型大鼠缺血面积减少(F=83.90,t_(LSD)=3.41,P<0.05)。Western blot结果显示,MCAO模型组大鼠脑组织中PKM2表达水平增高,与假手术组相比差异有显著性(F=3.60,t_(LSD)=5.10,P<0.05),Ala干预后脑组织中PKM2表达水平明显下降(t_(LSD)=6.20,P<0.05)。结论Ala可能通过抑制PKM2蛋白表达减轻脑缺血/再灌注损伤从而发挥神经保护作用。

ATG5对甲状腺乳头状癌细胞增殖的影响

目的通过模拟肿瘤微环境,观察自噬抑制后自噬相关蛋白5(ATG5)对甲状腺乳头状癌细胞增殖的影响。方法蛋白质印迹法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)实验检测甲状腺正常细胞系(Nthy-ori-3-1)和甲状腺乳头状癌K1细胞中ATG5蛋白和mRNA表达差异;培养敲除ATG5的shRNA-486和shRNA-938稳转细胞株,细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验和克隆形成实验分别检测在体积分数为10%血清培养条件下和体积分数为0.5%血清培养条件下,shRNA-486和shRNA-938与对照组对K1细胞增殖的影响。结果Nthy-ori-3-1细胞中ATG5蛋白表达量为0.682±0.037,低于K1细胞的1.933±0.010,t=32.330,P<0.001。Nthy-ori-3-1细胞中ATG5 mRNA表达量为0.503±0.017,低于K1细胞的0.902±0.016,t=17.140,P<0.001。转染ATG5-shRNA后,对照组LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值(5.521±0.205)低于shRNA-486敲除组(14.490±0.512)和shRNA-938敲除组(9.639±0.558);对照组p62表达量(1.335±0.0754)低于shRNA-486敲除组(2.593±0.081)和shRNA-938敲除组(2.830±0.066)。CCK-8增殖实验中,在10%血清培养条件下,对照组分别与shRNA-486敲除组和shRNA-938敲除组比较,敲除ATG5后促进了K1细胞的增殖,经两因素方差分析,F_(敲除)=38.590,P_(敲除)<0.001,F_(时间)=385.300,P_(时间)<0.001;在0.5%血清培养条件下,对照组分别与shRNA-486敲除组和shRNA-938敲除组比较,敲除ATG5后抑制了K1细胞的增殖,经两因素方差分析,F_(敲除)=14.730,P_(敲除)=0.005,F_(时间)=336.300,P_(时间)<0.001。克隆形成实验10 d后观察发现,在10%血清培养条件下,对照组分别与shRNA-486敲除组和shRNA-938敲除组比较,敲除ATG5后促进了K1细胞的增殖;在0.5%血清培养条件下,对照组与shRNA-486敲除组和shRNA-938敲除组比较,敲除ATG5后反而抑制了K1细胞的增殖,经两因素方差分析,F_(敲除)=76.380,P_(敲除)=0.001,F_(血清浓度)=1106,P_(血清浓度)=0.001。结论自噬对甲状腺癌K1细胞增殖的调控受癌细胞所处微环境的影响,在营养充足时,阻断自噬抑制了甲状腺癌细胞的增殖;在营养剥夺时,阻断自噬促进甲状腺癌细胞的增殖。