稳定表达鸡氨肽酶N的MDCK细胞系构建及其对传染性支气管炎病毒感染的影响

为研究鸡氨肽酶N(Chicken aminopeptidase N,c APN)在鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染细胞过程中作用,构建稳定表达c APN的MDCK细胞系。将重组质粒pc DNA3.1-c APN通过脂质体转染到MDCK细胞中并利用G418筛选,克隆纯化获得稳定表达c APN的MDCK细胞系。通过RT-PCR和间接免疫荧光检测表明c APN在MDCK细胞中持续稳定表达。IBV可以感染稳定表达c APN的MDCK细胞并连续传代,该细胞系接种IBV阳性样品24 h即可产生典型细胞融合病变,而对照MDCK细胞接种后没有细胞病变出现。结果表明c APN在介导IBV感染宿主细胞过程中发挥重要作用。

猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其S基因分子生物学特征的分析

为了解目前流行的猪传染性胃肠炎病毒（TG EV）的生物学特征及其遗传变异情况,从疑似感染TGEV的猪群中采集发病仔猪小肠,病料处理后在ST细胞上盲传,至第5代出现特征性细胞病变,通过PCR和间接免疫荧光验证,成功分离出2株TGEV,被命名为H E-1和HE-4。RT-PCR方法扩增测序其S基因,对14株TGEV S基因进化和变异情况进行分析。氨基酸比对发现,与TGEV经典毒株Purdue株相比,分离株在第562~564 aa处缺少N NT糖基化位点,与TS株相比在第375~377 aa处缺少ND T糖基化位点;同时,HE-4株在影响抗原位点D位点的第385 aa处发生突变。这种糖基化位点的缺失和抗原位点的突变,对TGEV生物学特性的影响有待进一步研究。

猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽的筛选及其抗病毒作用

把成功构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白的阳性重组质粒pET-32a(+)-M在大肠杆菌表达系统中进行诱导表达。以表达纯化的M蛋白作为靶蛋白,利用噬菌体展示技术对随机十二肽库进行筛选,4轮淘选后,挑选出了10个与PEDV及M蛋白特异性结合力高的噬菌体单克隆,序列测定后推导的氨基酸序列分别为AGWYCTEVLCV、AYCTRHVCYLDN,多肽被命名为M2、M9。就合成多肽体外抗病毒的效果而言,间接免疫荧光试验和实时荧光定量PCR试验证明,多肽M2、M9及多肽M2与M9联合使用均能够有效抑制病毒复制,且都呈剂量依赖性。其中多肽M2抑制病毒的作用比多肽M9的高,两种多肽联合抗病毒的作用最好。上述结果为进一步研究PEDV M蛋白功能性配体和研制防治PEDV的小分子治疗制剂提供了试验依据,奠定了理论基础。