山药块茎膨大期DoCDPK1基因生物信息学及低温胁迫下的表达分析

钙依赖性蛋白激酶(CDPK)在植物的生长发育及逆境胁迫方面发挥着重要作用。以大和长芋和毕克齐山药为试验材料,克隆钙依赖性蛋白激酶基因DoCDPK1,并对其进行生物信息学分析,为DoCDPK1基因的功能研究奠定基础。采用生物信息学方法分析DoCDPK1基因结构,构建瞬时表达载体,对DoCDPK1蛋白进行亚细胞定位;采用qRT-PCR分析DoCDPK1基因在不同山药品种的不同发育阶段及低温胁迫处理下的表达模式。结果表明(:1)DoCDPK1基因序列长度为2023 bp,编码521个氨基酸。(2)DoCDPK1与几内亚薯蓣CDPK蛋白序列的一致性为97%,且DoCDPK1存在STKc_CAMK结构域。(3)瞬时表达分析表明,DoCDPK1蛋白定位于细胞核与细胞膜。(4)大和长芋山药中的CDPK活性更高,DoCDPK1可能参与调控山药块茎膨大后期的生长发育。(5)经4℃低温胁迫后,CDPK活性降低,DoCDPK1表达量上调,且表达水平在不同时间处理下存在差异。综上所述,DoCDPK1可能参与调控山药块茎膨大后期的生长发育及低温胁迫响应过程。

山药(Dioscorea opposita Thunb.)赤霉素合成酶基因DoGA20ox1的克隆及功能研究

GA20-氧化酶(GA20ox)是赤霉素生物合成的关键限速酶,控制活性赤霉素的合成。以大和长芋山药和毕克齐山药为试验材料,采用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)技术克隆山药赤霉素合成酶基因(DoGA20ox1);分析该基因在2个品种山药不同器官及不同发育阶段的表达模式;构建瞬时、植物表达载体进行DoGA20ox1基因功能研究。结果表明:(1)DoGA20ox1基因的ORF长为1152 bp,编码383个氨基酸。氨基酸序列比对发现山药的DoGA20ox1与几内亚薯蓣的氨基酸序列相似度较高,都具有20G-Fe(Ⅱ)oxygenase保守结构域。(2)与cDNA对应的gDNA长度为1499 bp,包括3个内含子,4个外显子。(3)在烟草叶表皮细胞中瞬时表达表明,山药DoGA20ox1蛋白定位于质膜。(4)DoGA20ox1在毕克齐茎中及大和长芋叶中表达量最高,且在块茎的整个膨大期大和长芋的表达水平都显著高于毕克齐山药。(5)将DoGA20ox1基因转入烟草,检测结果表明该基因转录水平成功表达。本研究为深入探究DoGA20ox1生物学功能,解析山药块茎调控分子机制提供理论依据。

山药块茎膨大期淀粉积累及淀粉合成相关基因表达分析

为探讨山药块茎膨大期淀粉的积累机制,以大和长芋山药为试验材料,测定了块茎膨大期各类淀粉含量、淀粉合成关键酶活性以及淀粉合成相关基因的表达水平。结果表明,山药块茎膨大期总淀粉、直链淀粉及支链淀粉的积累呈先增加后降低的趋势,种植后150 d支链淀粉占总淀粉含量的88.35%,总淀粉含量的增加主要是支链淀粉的积累;ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉分支酶(SBE)与支链淀粉的积累呈极显著正相关,是直接参与支链淀粉积累的重要功能酶。AGPase、SSⅡ、SSⅢ、SBEⅡ基因的表达量与支链淀粉含量呈极显著正相关,是支链淀粉积累的关键因素。SBE对淀粉积累表现为直接正效应,AGPase和束缚态淀粉合成酶(GBSS)在直链淀粉积累中体现为直接正效应。这些研究对揭示山药块茎淀粉合成的分子机制具有重要意义。

山药异淀粉酶基因克隆及其在淀粉代谢中的作用

为了明确异淀粉酶基因(ISA 3)在山药淀粉代谢中的作用,该研究以‘毕克齐’和‘大和长芋’山药为试验材料,测定了块茎中淀粉及组分含量和异淀粉酶活性等;采用RT-PCR技术克隆了ISA 3,并进行生物学分析及山药块茎不同膨大期和不同组织间ISA 3基因的表达等。结果表明:(1)山药‘大和长芋’的直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量均显著高于‘毕克齐’,且两品种的淀粉含量随生长发育的变化均呈先升高后降低的趋势,并均于种植后120 d时达到最高,但‘毕克齐’的异淀粉酶(ISA)活性在整个膨大期均高于‘大和长芋’。(2)成功克隆获得山药ISA 3开放阅读框长1584 bp,编码527个氨基酸;ISA3为亲水性蛋白。(3)不同品种块茎在膨大时期的ISA 3基因表达趋势不同,‘毕克齐’中呈先显著上调随后下调,而在‘大和长芋’中表达总体下调,且在山药的叶、茎和块茎中均有表达,存在明显的组织特异性。(4)ISA活性与山药淀粉及支链淀粉含量呈显著和极显著正相关关系,但ISA活性与ISA 3的表达量呈负相关关系。研究表明,异淀粉酶参与了山药块茎中淀粉的合成,且主要对支链淀粉的合成起关键作用,ISA 3基因的表达可能对异淀粉酶活性和淀粉的合成起负调控作用。

光强对山药叶片结构和光合特性的影响

为探讨山药对不同光环境的适应机制,本研究以‘大和长芋’山药为试验材料,设置不同光强,比较分析不同光强下叶片形态结构、组织结构、超微结构、光合特性、光合产物及光响应基因表达量的变化。结果表明:(1)光强减弱,山药通过增大叶片面积、叶绿素含量,使叶片结构变疏松、细胞变小和类囊体基粒片层数增加,增加光吸收面积从而提高光吸收能力;(2)55%~70%遮光率下叶片净光合速率(P_(n))和蒸腾速率(T_(r))显著降低,淀粉及可溶性糖含量显著下降,山药通过提高叶片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性和CO_(2)同化率,降低弱光对光合作用的影响;(3)55%~70%遮光率下DA1、TCP-1、TOR-1、TOR-2表达量显著增加,DA1、TOR-2表达量与叶面积和叶片厚度呈显著正相关,正向调控山药叶片变大变厚,提高光能利用率。综上所述,山药在不同光强下通过调整叶片结构特征捕获更多的光能,弱光强下改变光合特性和光响应基因表达量以适应不同光环境,这为解析山药叶片应对不同光强的反应机制提供了理论依据。

光照强度对山药光合特性的影响和Rubisco羧化酶基因的克隆及表达分析

核糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合作用中参与CO_(2)同化的关键酶,Rubisco酶的活化取决于Rubisco活化酶(rubisco activase,RCA)的活性。为探讨不同光照强度下山药形态结构变化和生理响应特征,本试验以‘大和长芋’山药为材料,研究在全光照及2种不同透光率T1(60%~75%FL)、T2(30%~45%FL)下山药叶片形态结构、光合特性及块茎淀粉积累相关指标,采用RT-PCR技术克隆山药Rubisco羧化酶基因,并分析其表达模式。结果表明:山药在遮光下,叶面积分别增大17.2%和33.43%;对气孔开度的变化显著,叶片厚度显著降低且上表皮厚度也明显减少,栅栏组织细胞彼此融合而变粗,海绵组织细胞排列较稀疏。净光合速率、蒸腾速率和气孔导度随光照强度的降低而减小,胞间CO_(2)浓度没有明显变化;叶绿素含量显著上升以及Rubisco、RCA酶活力下降。遮光影响块茎的膨大,淀粉、蔗糖含量及相关酶活性呈不同程度的降低。山药Rubisco羧化酶基因(DoRbcL)的ORF长度为1752 bp,编码583个氨基酸,与几内亚薯蓣的氨基酸序列相似度较高。DoRbcL基因呈组织特异性表达,在叶中表达量最高且遮光后基因表达量显著降低,且与遮光程度呈正相关。这为解析山药对光照变化的适应性和响应机制提供了理论依据。

万寿菊离体快繁体系的建立

万寿菊是重要的经济花卉之一。本研究以万寿菊为试验材料,采用茎段为外植体,筛选离体快繁体系不同阶段的最适培养基;通过测定内源激素的含量,探讨不同浓度的外源植物生长调节剂对离体快繁的影响。结果表明:MS+0.5 mg/L 6-BA为万寿菊初代培养和继代培养的最适培养基,培养代数的增加导致植株成活率降低;1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA为最佳生根培养基,生根率为95%;移栽成活率为75%。内源激素含量可作为培养基添加生长素与细胞分裂素浓度的依据。研究结果为万寿菊组培苗的快速繁殖和产业化生产奠定了理论基础。