TBK1通过增强雌激素受体α的转录活性参与乳腺癌发生的分子机制

目的:研究乳腺癌细胞中TANK结合激酶1(TBK1)的功能及分子机制。方法:利用含有雌激素应答元件(ERE)的萤光素酶报告基因检测TBK1对雌激素受体α(ERα)转录活性的影响;将TBK1参与激活先天免疫途径的关键位点突变,使其丧失激活先天免疫的功能,再用同样方法检测TBK1突变体对ERα转录活性的影响;采用RT-PCR检测TBK1通过磷酸化修饰对ERα下游基因表达水平的影响。结果:TBK1增强ERα的转录活性,从而增强其下游基因的表达。结论:TBK1能以不依赖于其激活先天免疫途径功能的方式增强ERα的转录活性。

GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞HepG2炎症相关分子信号通路的影响

目的:通过构建高尔基体膜蛋白73(GP73)氨基酸序列109、144位糖基化位点双突变真核表达质粒,研究GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞炎症相关分子信号通路的影响。方法:根据GP73的DNA序列,设计合成2对针对GP73氨基酸序列109、144位糖基化位点突变的PCR引物,以本实验室构建的野生型质粒pc DNA3-Flag-GP73为模板,构建GP73的109、144位糖基化位点双突变质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM);用脂质体将此双突变质粒转染293T细胞,用糖蛋白染色和免疫印迹检测该质粒在细胞中的表达情况,用双萤光素酶报告基因实验检测GP73及其糖基化修饰对Hep G2细胞中NF-κB转录激活的影响。结果:糖蛋白染色和免疫印迹结果证实构建的双突变质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM)能够表达GP73双糖基化位点突变的蛋白,且糖基化位点的突变使GP73的糖基化修饰完全缺失;双萤光素酶报告基因实验结果表明,野生型GP73能够激活Hep G2细胞中NF-κB的转录活性,而双糖基化位点突变会使GP73失去此激活作用。结论:构建了GP73双糖基化位点突变的真核表达质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM)。GP73参与激活肝癌细胞炎症信号通路,糖基化修饰对于GP73发挥此作用是必不可少的。

MRE11参与炎症小体信号通路激活的初步研究

目的探究减数分裂重组蛋白11同系物A(MRE11)在不同刺激物诱导下炎症小体激活中的作用和地位。方法利用不同刺激物,如Poly(I∶C)、Poly(d A∶d T)、E.coli g DNA、293T g DNA和CPPD以及生殖疱疹病毒(HSV)等处理单核巨噬细胞THP-1,通过IL-1β酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)筛选出诱导激活炎症小体的有效刺激物;合成si MRE11干扰小RNA,转染THP-1细胞,免疫印迹检测MRE11干扰下调效率;利用筛选到的阳性刺激物处理MRE11干扰下调的细胞,采用ELISA和免疫印迹方法检测MRE11对细胞分泌炎性因子IL-1β水平和前胱天蛋白酶(pro-caspase)-1切割的影响。结果在MRE11干扰下调的THP-1细胞中,Poly(I∶C)、Poly(d A∶d T)、E.coli g DNA和293T g DNA刺激激活细胞分泌的IL-1β水平以及前胱天蛋白酶-1切割的水平均有不同程度降低。结论MRE11参与由DNA以及RNA刺激激活的炎症小体信号通路。