基于iTRAQ技术的猪精子释放蛋白Transwell小室分离及差异性分析

【目的】探索分离猪附睾头部精子释放蛋白的新方法,确定释放蛋白的功能特点及信号通路。【方法】利用Transwell小室独特的共培养系统,充分利用0.4μm聚碳酸酯膜分离精子释放的蛋白。使用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术分析释放的蛋白,对鉴定到的差异蛋白,使用GO数据库描述蛋白功能,运用KEGG数据库Pathway分析,确定差异蛋白最主要的生化代谢途径和信号转导途径,同时用IPR数据库对差异蛋白的结构域进行非冗余分析。【结果】Transwell小室上、下室共鉴定到542种蛋白,其中,464种蛋白表达量显著上调,78种蛋白表达量显著下调。差异蛋白主要参与跨膜转运、离子运输、ATP合成等生物过程。差异蛋白主要参与的信号通路为醛固酮调节的钠盐吸收、囊泡转运、EGFR酪氨酸激酶抑制等。硫氧还蛋白、半乳糖、糖苷水解酶等构成差异蛋白的主要结构域,为蛋白发挥作用提供结构基础。【结论】Transwell小室分离蛋白的方法切实有效,iTRAQ技术在附睾头部精子释放蛋白中成功鉴定出差异蛋白,差异性分析及功能注释为探究差异蛋白参与的生命活动及功能奠定了基础。

广西猪源产肠毒素大肠杆菌毒力因子及多重耐药性分析

本研究旨在探究广西某猪场可能存在的病原菌及其致病的主要原因。试验采用细菌分离纯化、形态学鉴定、生长曲线测定、生化分析及药敏试验等进行细菌的分离鉴定,应用PCR技术对菌株16S rRNA、毒力基因及耐药基因进行检测。结果表明,该由病料分离的菌株为无芽孢、有菌毛、两端钝圆的粗短杆状的革兰氏阴性菌,其繁殖能力强、生长迅速,疑似为大肠杆菌。16S rRNA扩增结果显示,出现大小为1 474 bp的条带,测序结果表明其与大肠杆菌的同源性可达99%。该菌株对31种常见抗菌药物表现出极强的耐药性,对庆大霉素、替米考星、四环素、恩诺沙星、青霉素、林可霉素、磺胺甲噁唑等均呈现较高的耐药水平,耐药率高达87.10%(27/32),仅对阿米卡星、黏菌素2种药物敏感。毒力因子检测共鉴定致病岛FyuA、肠毒素STb和LT及黏附素F41和K88共5种毒力因子,检出率为35.70%(5/14)。扩增出β-内酰胺酶类bla_(TEM)和bla_(OXA)、四环素类tet(A)、磺胺类Sul2、氨基糖苷类aadA1和aac(3′)-Ⅱa、喹诺酮类GyrA、GyrB和ParC及氯霉素floR共10种耐药基因,检出率为66.70%(10/15),且耐药基因的检出与耐药表型呈正相关。综上,该菌株含多种毒力因子,耐药型复杂,多重耐药性情况严重,需采取相应的预防措施,防止蔓延和传播。

单株猪红斑丹毒丝菌的生物学特性及耐药性分析

为探究2018年7月广西南宁市武鸣区某规模化肉猪场保育猪急性死亡的病因,本研究通过细菌的分离鉴定、16S rRNA的扩增、生物被膜体外形成条件的测定、毒力基因检测、药物敏感性试验、耐药基因检测等试验方法,对可能存在的病原菌的生物学特性及耐药性进行分析。结果表明:该菌为稍直或弯曲的革兰氏阳性杆菌,且与猪红斑丹毒丝菌在基因上的同源性最高,鉴定为猪红斑丹毒丝菌。该菌株生长迅速,在室温28℃时具有较强的生物被膜体外形成能力;毒力基因检测结果表明含有荚膜多糖CPS-A、黏附素RspA、表面保护性抗原SPaA共3种毒力基因;该菌株耐药性强,耐药率高达68.18%,仅对米诺环素、多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考4种药物敏感,并扩增出blaTEM(788 bp)、Sul2(435 bp)两种耐药基因,其耐药表型与耐药基因检出呈现正相关。本研究将为预防猪红斑丹毒丝菌的传播及临床用药提供指导性意见。

猪PFKL基因克隆及生物信息学分析

试验旨在探究猪精液6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase,PFKL)基因的理化性质和结构特点,以期阐明糖酵解在精子发生过程中的生理作用及调控机制。通过RT-PCR技术扩增PFKL基因,将获得的基因片段插入到pUC57载体上进行克隆测序,并结合生物信息学方法预测和分析其氨基酸序列、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、抗原位点、功能注释等。结果表明,PFKL基因全长2349 bp,编码782个氨基酸,蛋白质分子质量为83.819 ku,等电点为6.96,为酸性蛋白质,分子式为C3674H5897 N1051O1109S40。猪源PFKL基因与鼠、鸭、羊、牛、猩猩、人的参考序列同源性均高达80.0%以上。该蛋白不存在跨膜结构和信号肽区域,含有2个N-糖基化修饰位点、14个O-糖基化位点、35个磷酸化位点。PFKL蛋白三维建模结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,与肌肉型磷酸果糖激酶和血小板型磷酸果糖激酶的同源性分别为68.24%和70.84%。PFKL基因含有的27个抗原位点强弱不同,柔韧性分布较均匀,有较高的表面可塑性,且存在PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,为具有较多潜在B细胞抗原表位的亲水性蛋白。GO功能注释分析结果表明,PFKL基因具有碳水化合物激酶活性、磷酸果糖激酶活性,能够参与己糖代谢和单糖代谢。本研究结果为改善精子品质和提高精卵结合发生率奠定了分子生物学基础。

广西部分地区猪链球菌血清型及其毒力因子流行性调查分析

为探究广西部分地区猪链球菌(Streptococcus suis,SS)流行菌株主要血清型及毒力因子分布情况。本试验于2018年1月至2018年6月对从多个猪场采集到的116份疑似链球菌感染的组织病料(脑、肺脏、淋巴结等)进行病原菌检测,采用细菌分离鉴定、形态学观察及PCR扩增等方法对病原菌及其血清型和部分毒力因子进行鉴定。结果显示,116份样品共分离到链球菌32株,阳性率为27.59%(32/116),其血清型主要以SS2和SS9为主,分离率分别为40.63%(13/32)和43.75%(14/32),其他血清型为15.63%(5/32);毒力因子检测结果表明:SLY、MRP、EPF以及SBP2′因子的检出率分别为:81.25%(26/32)、59.38%(19/32)、50.00%(16/32)和71.88%(23/32)。32株链球菌中以SLY^+MRP^+EPF^+SBP2′^+(13株)、SLY^+MRP^-EPF^-SBP2′^-(5株)、SLY^+MRP^+EPF^-SBP2′^+(5株)为主要的毒力基因型,其中SS2均能检测出3个或3个以上的毒力因子。玉林、柳州市主要分布SS9型,南宁、百色市主要分布SS2型;广西不同地区毒力因子的分布情况存在差异且不同血清型或同一血清型的链球菌毒力因子的分布情况也各不相同,其中SS2携带的毒力因子检出率明显高于其他血清型。该研究可为今后猪链球菌疫苗及致病机理研究提供理论依据,为广西地区猪场链球菌血清型疫苗选择提供指导。

产志贺毒素多重耐药大肠杆菌噬菌体的生物学特性及全基因组分析

为探明大肠杆菌噬菌体的生物学特性和全基因组特征,本研究以在广西某猪场污水中分离得到的1株产志贺毒素且多重耐药的大肠杆菌GXEC010为宿主菌,同时在污水中分离到1株具有裂解作用的噬菌体,并通过透射电镜观察、最佳感染复数测定、一步生长曲线绘制、热敏感性与酸碱度稳定性评估、杀菌试验及全基因组测序等方法分析该噬菌体的生物学特性与基因组特征。结果表明,分离纯化得到能高效裂解大肠杆菌GXEC010的噬菌体,命名为vB_EcoM_BP10,其噬菌斑呈清晰透明,边缘光滑整齐;该噬菌体的最佳感染复数为1;一步生长曲线结果显示,感染宿主菌潜伏期为5 min,爆发期为65 min,爆发量为51;可耐受温度范围为30~60℃,在pH为5~8的环境中能维持稳定性;噬菌体杀菌试验结果显示,感染复数(MOI)为1时噬菌体vB_EcoM_BP10具有良好的杀菌效果。全基因组测序结果表明,噬菌体vB_EcoM_BP10基因组总片段长度为52288 bp,GC含量为44.16%,含有71个阅读框(ORF)。GO功能注释表明,噬菌体vB_EcoM_BP10可参与小分子代谢、细胞氮化合物代谢等生物学过程中,具备核苷酸转移酶活性、离子结合、DNA结合等分子功能。与Escherichia phage ST32、Enterobacteria phage phiEcoM-GJ1的亲缘关系较近。综上所述,噬菌体vB_EcoM_BP10具有清晰的宿主受体特异性,良好的热稳定性和酸碱稳定性,本研究结果能为有效防控产志贺毒素多重耐药大肠杆菌奠定一定的理论基础。

他克林对脂多糖诱导小鼠睾丸支持细胞炎性损伤的保护作用

【目的】分析他克林对脂多糖(LPS)诱导小鼠睾丸支持细胞(TM4)炎性损伤的保护作用,从炎症角度探索他克林的功能,为动物生产过程中雄性动物生殖疾病相关抗炎药物的利用及精子质量提升提供更多药物选择。【方法】采用CCK8法检测0.01、0.10、1.00、10.00和100.00μg/mL LPS分别诱导3.0、6.0、12.0和24.0 h对TM4的适宜损伤条件;同时分析0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00、10000.00和100000.00μg/mL他克林在加入LPS前预处理0.5、1.0和2.0 h或加入LPS后处理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0和24.0 h对TM4炎性损伤的适宜保护条件。以荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测TNF-α和IL-6基因mRNA表达水平,以ELISA法进一步评价细胞上清TNF-α和IL-6蛋白表达量,以免疫蛋白印迹(WB)法分析NF-κB蛋白表达量。【结果】不同浓度不同处理时间下,LPS对TM4增殖的影响情况存在差异,其中1.00μg/mL LPS处理12 h TM4的增殖率极显著低于空白组(P<0.01,下同)。他克林对TM4炎性损伤的保护作用与处理时间和剂量有关,其中,10000.00μg/mL他克林预处理2.0 h的TM4增殖率显著低于空白组(P<0.05,下同),10000.00、100000.00μg/mL他克林预处理0.5和1.0 h或后处理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0和24.0 h的TM4增殖率均极显著低于空白组,而0.01μg/mL他克林后处理6.0 h的保护作用最佳,其TM4增殖率显著高于空白组。与空白组相比,LPS可显著上调TM4的IL-6和TNF-α基因mRNA及蛋白表达量,而与LPS组相比,0.01μg/mL他克林显著下调其表达量。与空白组相比,LPS可显著上调TM4的NF-κB蛋白表达量;1.00、100.00和10000.00μg/mL他克林可极显著上调NF-κB蛋白表达量,而与LPS相比,0.01μg/mL他克林降低NF-κB蛋白表达量,但差异不显著(P>0.05)。【结论】0.01μg/mL他克林后处理6.0 h对TM4的保护作用最佳,其机制可能与IL-6和TNF-α基因mRNA及蛋白表达量下调有关。

精液中去获能因子的研究进展

精子与卵母细胞融合形成新生命是高度契合的复杂事件,获能反应的发生对该进程具有关键性的作用。精子为完成获能反应,会释放稳定质膜状态的因子,这些因子被定义为去获能因子,过早释放或者异常释放去获能因子,将引起精子的质膜不稳定提前获能,最终影响精子进入雌性生殖道的运动能力。目前,对去获能因子的研究,主要集中在分离鉴定及功能探究,并取得一定的进展。本文对近年来探究的去获能因子按照作用机理进行了分类,归纳总结了功能特征等方面的信息,为改善精子获能条件和提高精卵结合发生率奠定分子生物学基础,对解释获能现象及精卵结合机制提供更深层次的科研思路。

金雀异黄酮对猪精子冻后质量及获能状态的影响

分别在精液冷冻稀释液中添加不同浓度(0,25,50,75,100μmol/L)的金雀异黄酮,按照不同时间(30,60,90 min)孵育后冷冻。解冻后检测精子活力、顶体完整率和质膜完整性等表观指标;分光光度计检测各组Ca^2+浓度,金霉素染色检测精子获能状态。结果显示,当精液冷冻液中添加100μmol/L的金雀异黄酮孵育60 min后冷冻,解冻后精子活力提高,与对照组相比差异极显著(P<0.01),顶体完整率和质膜完整性略高于空白对照组;Ca^2+浓度低于其他处理组;B型精子数降低,与对照组相比差异显著(P<0.05)。综上所述,金雀异黄酮能够通过抑制精子冷冻过程中的被动获能,显著改善猪精液的冻后质量。