脊髓缺血再灌注损伤对大鼠CaMKIV基因及蛋白表达的影响

目的分析大鼠脊髓缺血再灌注损伤(SCII)后钙调蛋白依赖性蛋白激酶4(Ca MKIV)基因及蛋白表达的变化。方法雄性SD大鼠84只,按随机数字表法分为假手术组、SCII 0 d组、SCII 1 d组、SCII 3 d组、SCII 7 d组、SCII 14 d组、SCII 28 d组,每组12只。假手术组仅暴露肾动脉下腹主动脉,不阻断。SCII各组采用Naslund法阻断腹主动脉,复制SCII模型。采用免疫组织化学法、Western blot、实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测各组大鼠Ca MKIV蛋白及基因的表达,BBB评分评价大鼠后肢运动功能。结果免疫组织化学法结果显示,假手术组Ca MKIV蛋白表达很少,SCII组Ca MKIV蛋白高表达于神经元的细胞浆和细胞核;在伤后3 d,Ca MKIV阳性细胞数最多,且高于假手术组(P<0.05)。Western blot结果提示,Ca MKIV蛋白表达在再灌注0 d即高于假手术组(P<0.05),于再灌注3 d达峰值后逐渐降低;至28 d,Ca MKIV蛋白表达量与假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。q RT-PCR结果表明,Ca MKIV基因表达在再灌注0 d开始增加,与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05),于3 d达峰值后降低,至28 d仍高于假手术组(P<0.05)。BBB评分显示,SCII各组大鼠后肢功能随再灌注时间延长有所改善,但至28 d时仍差于假手术组。结论 SCII早期可快速诱导Ca MKIV基因表达上调和蛋白合成,Ca MKIV在SCII中可能发挥重要作用。

缺氧诱导因子1α对人羊膜间充质干细胞耐受缺氧能力影响的实验研究

目的通过瞬时转染缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因,观察缺氧处理后人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)成活及凋亡情况,探讨HIF-1α对hAMSCs耐受缺氧能力的影响。方法取健康剖宫产产妇自愿捐赠的羊膜组织分离、培养hAMSCs,通过倒置相差显微镜观察细胞形态及免疫荧光法检测干细胞标志物OCT-4、NANOG表达,对培养细胞进行鉴定。取第3代hAMSCs进行缺氧处理(200μmol/L CoCl_2)后,按以下分组瞬时转染对应质粒:A组为hAMSCs空白组,B组为pcDNA3.1阴性对照组,C组为shRNA阴性对照组,D组为shRNA-HIF-1α干扰组,E组为pcDNA3.1-HIF-1α过表达组。缺氧处理后12、24、48 h采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测各组细胞成活率;24 h采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,并采用Western blot检测HIF-1α、VEGF、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma2,Bcl-2)、Bax、活化型半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3,C-Caspase-3)蛋白表达。结果 CCK-8法检测示,缺氧处理后各时间点与A、C组比较,D组细胞成活率明显降低(P<0.05);与A、B组比较,E组细胞成活率明显升高,其中24 h组间比较差异有统计学意义(P<0.05);E组内24 h时细胞成活率明显高于12、48 h时(P<0.05)。流式细胞仪检测示,与A、C组比较,D组细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与A、B组比较,E组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。Western blot检测示,与A、C组比较,D组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显减少,Bax、CCaspase-3蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);而E组结果相反,与A、B组比较,E组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显增加,Bax、C-Caspase-3蛋白表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HIF-1α基因过表达能够明显改善hAMSCs耐受缺氧能力,其机制可能与上调VEGF和Bcl-2表达及下调Bax和C-Caspase-3表达作用相关。