牛膝多肽活性成分联合tPA治疗对大鼠缺血性卒中亚急性期和慢性期的作用

目的:研究牛膝多肽活性成分(Achyranthes bidentata polypeptide k,ABPPk)联合组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)治疗对大鼠缺血性卒中亚急性期和慢性期的作用。方法:建立大鼠血栓性大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,分为4组:假手术组、生理盐水组、延迟的tPA单独治疗组、ABPPk+tPA联合治疗组。于缺血后6 h、1 d、3 d、7 d行改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score,mNSS),缺血后7 d亚急性期行生存率分析,行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色评价脑梗死和脑水肿体积,行荧光葡聚糖染料静脉灌注评价脑微血管通畅率,行CollagenⅣ免疫荧光化学染色评价血脑屏障完整性;于缺血后42 d慢性期行Morris水迷宫实验评价大鼠学习记忆能力。结果:ABPPk与tPA联合治疗缺血性卒中,可有效延长tPA治疗时间窗,延长缺血性卒中亚急性期生存率,改善其神经行为学评分,改善脑微血管通畅率,维持血脑屏障完整性,改善慢性期学习记忆能力。结论:ABPPk可作为tPA辅助治疗药物,联合用于治疗缺血性卒中。

苦参不同组织中生物碱类成分的LC-MS分析

目的 通过对苦参Sophora flavescens不同组织样品中生物碱类成分的LC-MS分析,探讨苦参中生物碱类成分的质谱裂解规律及其在不同样品中的异同。方法 首先利用UPLC-Q-Exactive-OrbitrapMS对5年生苦参根中的生物碱类成分进行全面的鉴定分析。再利用UPLC-QQQ-MS/MS技术,对苦参无菌幼苗不同组织部位(根、茎、叶)、苦参愈伤组织中的生物碱类成分进行定量分析,比较各样品中生物碱类成分的异同。结果 从5年生苦参根中共鉴定出47个生物碱类成分;利用UPLC-QQQ-MS/MS对其中17个主要的生物碱类成分进行了定量分析,发现不同苦参样品中生物碱类成分差异明显,其中苦参无菌幼苗各组织部位中生物碱的含量相对较高。结论 建立了一种苦参生物碱类成分快速定性定量分析方法,从5年生苦参根中快速鉴定出47种生物碱;通过对苦参不同组织样品中17个生物碱类成分的定量分析,为后续利用比较转录组测序技术,挖掘并鉴定苦参中生物碱类成分生物合成关键酶的研究奠定基础。

新型免疫抑制剂brasilicardin A的研究进展

Brasilicardin A(BraA)是从致病性放线菌巴西诺卡菌(Nocardia brasiliensis)IFM 0406中发现的具有显著免疫抑制作用(IC_(50)=0.057μg/mL)的二萜糖苷类化合物。BraA发挥免疫抑制活性的作用机制与现有临床常用的免疫抑制剂不同,BraA通过抑制氨基酸转运体L系统的转运进而影响T-淋巴细胞对氨基酸的摄入而发挥免疫抑制作用。相比目前已知的免疫抑制剂环孢菌素A、子囊霉素和他克莫司等,BraA在小鼠混合淋巴细胞反应中显示低毒、高效的优势。因此,BraA作为新型的免疫抑制剂,极具开发潜力,已成为全球免疫抑制剂发现新领域。但其结构复杂、合成困难,原菌种产率低且具有致病性,BraA及其类似物的获得已成为此类新型免疫抑制剂研究的瓶颈。本文综述了BraA的分子特征、药理活性、作用机制、目前获得的BraA类似物和衍生化方面的研究进展,以期为BraA及其类似物的高效生产提供参考。

氯化钠诱导白木香悬浮细胞合成苯乙基色酮类成分的LC-MS分析

采用超高效液相色谱-串联四极杆静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive-MS)结合超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱(UPLC-QQQ-MS/MS)对氯化钠诱导的白木香悬浮细胞中苯乙基色酮类成分进行定性和定量分析。UPLC-Q-Exactive-MS和UPLC-QQQ-MS/MS均采用Waters T3色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.8μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相分别进行梯度洗脱色谱分离,质谱分析均采用电喷雾正离子模式采集。利用UPLC-Q-Exactive-MS从氯化钠诱导的白木香悬浮细胞样品中鉴定出苯乙基色酮类化合物47个,其中简单苯乙基色酮及其苷22个、四羟基四氢苯乙基色酮10个、三元氧环四氢苯乙基色酮15个。通过UPLC-QQQ-MS/MS技术对氯化钠诱导处理后白木香悬浮细胞中25个苯乙基色酮进行了定量。通过2种液质联用技术快速、高效地对氯化钠诱导白木香悬浮细胞中苯乙基色酮类成分进行定性、定量分析,为利用体外培养等生物技术制备沉香中主要的药效和香味物质苯乙基色酮提供重要参考。

蛇足石杉内生真菌产黄青霉菌MT-40中xanthocillin类似物生物合成基因簇的挖掘及鉴定

Xanthocillin具有显著的抗菌活性,结构中含有独特的异腈基。本文通过对蛇足石杉(Huperzia serrata)内生真菌产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)MT-40基因组的测序分析,利用本地BLAST等生物信息学分析工具挖掘具有合成xanthocillin类似物潜力的基因簇,结合米曲霉(Aspergillus oryzae)NSAR1异源表达技术实现基因簇中关键基因的功能鉴定。结果成功从内生真菌P.chrysogenum MT-40中发现一个合成xanthocillin类似物的生物合成基因簇(命名为for),for基因簇中的关键生物合成基因forB编码的异腈基合成酶可以催化合成2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid,基因forG编码的P450酶可以催化2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid的二聚化生成xanthocillin类似物N,N′-(1,4-bis(4-hydroxyphenyl)buta-1,3-diene-2,3-diyl)diformamide。本文研究结果为进一步从真菌中发现xanthocillin类似物提供参考。

白木香细胞色素P450还原酶基因的克隆、表达与功能鉴定

细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)是细胞色素P450酶电子传递链的组成部分,在生物体内起着重要的电子传递作用。本研究从白木香(Aquilaria sinensis)愈伤组织细胞中克隆得到1个CPR基因(Ascpr1),Ascpr1含有一个2124 bp的开放阅读框,编码707个氨基酸残基,其蛋白分子质量为78.82 kD。系统进化分析显示,AsCPR1为Ⅱ型CPR蛋白,与来源于可可树(Theobroma cacao)的CPR蛋白亲缘关系较近。跨膜预测结果显示该蛋白的第52~71位氨基酸为跨膜区,在大肠杆菌Transetta(DE3)中成功表达了N-端缺失67个氨基酸残基的融合蛋白,经亲和色谱纯化后获得对细胞色素C具有还原能力的融合蛋白AsCPR1。本研究结果为进一步研究P450酶参与的白木香防御物质合成及CPR在白木香防御反应中的作用奠定基础。

蛇足石杉中赖氨酸脱羧酶基因的克隆表达及功能鉴定

赖氨酸脱羧酶是石杉碱甲等石松生物碱上游生物合成步骤中催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺(尸胺)的关键酶。通过对蛇足石杉(Huperzia serrata)转录组数据的挖掘分析,并结合RT-PCR技术从蛇足石杉中成功克隆出3个赖氨酸脱羧酶基因(HsLDC-L1、HsLDC-L2、HsLDC-L3);利用在线生物信息学分析软件以及DNAMAN、MEGA 7.0等对上述3个基因编码蛋白的性质、二级和三级结构、序列同源性、进化关系等进行了预测分析,发现3个基因编码蛋白均具有植物赖氨酸脱羧酶的保守结构域和活性位点,且与文献报道的产石杉碱甲植物中的赖氨酸脱羧酶具有较近的亲缘关系。进一步尝试利用不同载体在大肠杆菌中对上述3个基因进行表达,结果仅HsLDC-L1与载体pCold TF构建的重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功实现可溶性表达,利用Ni^(2+)亲和色谱柱分离纯化得到重组蛋白HsLDC-L1;HsLDC-L1全长由469个氨基酸组成,理论分子质量为50.50 kDa。体外酶活性分析证明HsLDC-L1可以催化赖氨酸脱羧生成尸胺。底物适应性实验发现HsLDC-L1还可以催化鸟氨酸脱羧生成腐胺,但不能催化酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸脱羧。上述结果为进一步研究包括石杉碱甲在内的石松类生物碱的生物合成提供参考,为利用合成生物学策略构建产Δ^(1)-哌啶、石榴碱等石松类生物碱生物合成关键前体的工程菌提供重要的基因元件。