疱疹病毒TK基因的研究进展

简述了疱疹病毒具有表达外源基因的优势,介绍了TK基因作为疱疹病毒化学治疗和构建疱疹病毒基因缺失疫苗的首选靶基因。从TK基因的特点、TK基因的表达调控、TK酶生化特性、TK的功能域等方面做了综合论述,并对其今后的研究和应用前景进行了讨论。

鸭瘟病毒TK基因的克隆及其分子特性分析

通过测定动物疫病与人类健康四川省重点实验室构建的鸭瘟病毒(duck plaque virus,DPV)DNA基因文库中重组质粒的DNA序列,得到了该病毒胸苷激酶(TK)基因的ORF。采用PCR扩增出了DPV TK基因并将其克隆到pMD18-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切(BamHⅠ+HindⅢ)鉴定,并利用生物信息学软件Genscan、ProtScale、SignalP2.0、Scansite、TMpred、Prosite、DNAStar以及在线Predictprotein等分析了TK基因的分子特性。结果显示,DPV TK具有疱疹病毒的典型特征,含有ATP结合结构域和核苷酸结合结构域2个功能结构域,且具有与功能相关的磷酸化位点和氨酰化位点;编码的多肽链中亲水区域大于疏水区域,是一种膜外蛋白。DPV TK基因与禽类疱疹病毒(α-疱疹病毒)的进化关系最近。

鸭瘟病毒dUTPase基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主亚细胞中的定位分析

根据笔者实验室新发现的鸭瘟病毒(DPV)dUTPase基因(GenBank登录号DQ486149)序列设计1对引物,PCR扩增后将产物亚克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得表达质粒pET32a-DU。然后将其转化至E.coliBL21(DE3)进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达蛋白约66.8 ku,与预期表达蛋白大小一致。薄层扫描分析表明重组蛋白占菌体总蛋白的36.2%,主要以包涵体的形式存在。重组蛋白纯化后制备兔抗血清,间接ELISA效价为1∶409 600。通过免疫荧光技术进行DPV dUTPase亚细胞定位检测,结果显示最早可在感染后4 h的胞质中检测到特异性荧光,12 h大量点状绿色荧光聚集于胞核;24 h后胞核内点状荧光减弱,而胞质点状荧光增强;48 h胞核和胞质荧光均显著减弱。本研究为DPV dUTPase基因功能和DPV致病机理的研究提供了重要数据。

鸭瘟病毒UL24基因的分子特征分析

根据本实验室获得的鸭瘟病毒的一段基因序列设计引物，利用PCR扩增UL24基因并克隆到pMD18-T载体，阳性重组质粒进行酶切鉴定、测序验证与生物信息学分析。结果显示，获得的UL24基因全长1230bp，编码409个氨基酸；与其他26株疱疹病毒科中α-疱疹病毒亚科的UL24基因的相似性较β和γ亚科高，其中与α亚科禽疱疹病毒属中的GaHV-3相似性最大（34．7％）；遗传进化树显示，该基因编码的蛋白与火鸡疱疹病毒的UL24蛋白的亲缘性最近。该蛋白是一种保守但不含信号肽的外膜蛋白，具有5个潜在的N-糖基化位点和19个磷酸化位点；编码的氨基酸Ala，Apn，Glu，Phe，Leu，Arg，Thr，Val具有一定的偏嗜性。二级结构分析显示，α螺旋和无规卷曲含量高，均达46．94％，而口折叠仅占6．11％；同源建模比对，未发现与之匹配的三级结构；预测的抗原表位主要位于肽链第36～48、241～323、344～379位区段。

鸭瘟病毒dUTPase基因的分子特性及转录时相分析

应用大量生物信息学分析工具及 RNA 斑点杂交技术对本实验室构建鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)CHv 株基因文库时新发现的 dUTPase 基因(GenBank 登录号DQ486149)进行了分子特性及转录时相分析。研究表明:该基因大小为1344bp,编码447个氨基酸,包含 dUTPase 家族蛋白的5个保守 motifs,排列形式3-l-2-4-5具备Ⅱ型 dUTPase的典型特征。DPV CHv dUTPase 基因在25个疱疹病毒参考株之间高度保守,并与 a 疱疹病毒的氨基酸同源性较之与β、γ疱疹病毒要高。DPV CHv dUTPase基因转录检测发现DPV 感染宿主细胞后最早30rain 可检测到该基因转录产物,随后转录产物量迅速放大,4h达高峰,24h 后下降至相对低的水平。该研究为阐明病毒基因表达调控机理提供了有用的实验数据,并对病毒其他基因的发现和研究具有指导性意义。

鸭瘟病毒UL51基因在感染宿主细胞中的定位和转录特征

对鸭瘟病毒(DPV)UL51基因在感染宿主细胞内的定位和转录时相进行分析,为进一步研究该基因的特性和功能提供有用的试验数据和材料。构建pET32a-UL51原核表达载体,将其转化至E.coliBL21(DE3)中进行IPTG诱导表达后,用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱层析法纯化该表达产物。以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子,制备兔抗UL51多克隆抗血清,通过间接免疫荧光和RT-PCR法检测该基因在DPV感染的鸭胚成纤维细胞(DEF)内的定位和转录情况。间接免疫荧光结果显示,最早可在感染后8h的胞浆中检测到特异性荧光点,24～36h有大量绿色荧光团块聚集于近核区域,之后随着细胞病变的增强,胞浆中的绿色荧光开始减弱,且在感染晚期的胞核中也出现了少量弥散的绿色荧光。RT-PCR结果显示,DPVU L51基因从感染后4h开始转录,其后转录量不断增大,从6～48h一直保持在较高水平,之后又降低。DPVU L51蛋白主要定位于感染的宿主细胞的胞浆中特别是近核区域,与其在α-疱疹病毒中的同源物的定位结果一致;并且与其他几种α-疱疹病毒的转录情况对比后,可认为该基因是一个晚期(γ类)基因。