血小板检测结果异常时3种检测方法的比较和评估

目的:比较评估血小板检测结果异常时阻抗法、光学法和涂片镜检法3种检测方法的临床应用价值。方法:选取XE-2100全自动血细胞分析仪利用阻抗法进行的全血细胞分析中血小板报警信息提示结果可信度降低的样本,进行光学法血小板检测和涂片镜检法血小板复检,比较并分析这3种检测方法的结果。结果:大部分样本经过光学法复检可以纠正阻抗法可信度降低的结果,部分样本经过光学法依然不能纠正,主要原因在于检测结果没有满足仪器设定的纠正条件,需要涂片染色显微镜下核查血小板的数量。结论:当XE-2100全自动血细胞分析仪检测血小板结果异常时,需要用光学法纠正,若还是无法纠正,则需要手工推片染色镜检来确认。3种方法各有利弊,需互补使用。

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立

目的建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法。方法以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度。结果 (1)设计的引物能够扩增出特异性条带;(2)扩增体系中0.5μl探针的扩增效果优于1.0μl探针;(3)Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10-1 mg/L;(4)在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100%。结论成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值。

基于LAMP技术针对溶藻弧菌gyrB基因快速检测方法的建立

目的应用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立针对溶藻弧菌gyrB基因的快速检测方法。方法以溶藻弧菌标准株(ATCC-17749)和溶藻弧菌野生株(WT)为研究对象,通过在线生物学软件(http://primerexplorer.jp/e/)设计针对溶藻弧菌gyrB基因的LAMP引物,利用恒温水浴进行等温扩增,优化反应条件,建立快速检测方法。结果①经2g/dl凝胶电泳结果显示反应温度为61℃时扩增产物成像效果较60℃,62℃和63℃明显,为适宜反应温度;②在61℃条件下反应60 min和90 min凝胶电泳成像效果差异不大,反应时间为60 min能满足扩增需要;③利用同一体系对临床6种其它常见致病菌进行等温扩增时未出现阳性条带,提示整个体系特异度较好;④采用模板稀释法验证该LAMP体系检测的灵敏度为10-4mg/L。结论建立了基于LAMP技术针对溶藻弧菌gyrB基因的快速检测方法,具有良好的特异度和敏感度,对快速检测溶藻弧菌有重要意义。

针对副溶血性弧菌toxR基因的RPA-CRISPR/Cas13a荧光快速检测方法的建立及应用

目的探讨并建立非专业实验室场景下恒温、快速及简便的检测副溶血性弧菌的方法.方法本研究针对副溶血性弧菌toxR基因设计特异性引物和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA),建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR及其相关蛋白13a(CRISPR-Cas13a)的反应体系,采用自配十二烷基硫酸钠(SDS)核酸快速提取试剂提取样本全基因组,并结合荧光法实现检测结果的可视化判读.结果利用副溶血性弧菌菌株ATCC 17802和其他3种非副溶血性弧菌(溶藻弧菌、河流弧菌和梅氏弧菌)以及3种临床上常见腹泻致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌)对RPA-CRISPR/Cas13a荧光法的特异性进行验证,结果显示特异性为100.00%;对副溶血性弧菌基因组DNA进行倍比稀释并检测,该方法最低检出限为102 copies/μl.最后,将建立的方法应用于野生型副溶血性弧菌检测,检测结果与TaqMan定量聚合酶链式反应(TaqMan-qPCR)检测结果及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定结果一致.结论本研究建立了一种针对toxR基因的RPA-CRISPR/Cas13a检测方法,具有简便、快速、特异性强、结果判读可视化等优点,为非专业实验室场景下的副溶血性弧菌快速检测提供了较好工具.