筛选脱氮假单胞菌启动子提高维生素B_(12)产量

维生素B_(12)(VB_(12)/钴胺素)具有多种生理学功能,广泛应用于制药、食品等行业。脱氮假单胞菌是维生素B_(12)常用工业菌株之一。通过筛选高表达启动子来过表达VB_(12)合成途径基因,能有效提高菌株的VB_(12)生产能力。通过对脱氮假单胞菌中某些编码热激蛋白和分子伴侣基因前含启动子在内的非编码序列用启动子在线预测软件进行分析,选取P_(ibpA)、P_(cbpA)、P_(dnaJ)、P_(htpG)、P_(dnak)、P_(grpE)的非编码区与编码绿色荧光蛋白的GFP报告基因相连,通过酶标仪检测GFP的荧光信号值,对编码热激蛋白和分子伴侣基因前的非编码区所含有的启动子的表达强度进行评估,以获得高表达的启动子对VB_(12)合成途径的基因进行过表达。结果表明,含有启动子P_(dnak)的非编码区,其表达的GFP荧光值最高。进而构建强启动子P_(dnak)与维生素B_(12)合成途径基因cobA的过表达重组菌,发酵数据表明,与对照菌株相比重组菌株维生素B_(12)产量提高21.5 mg/L。筛选高表达启动子用于维生素B_(12)合成途径关键基因的表达,是一种有效的提高维生素B_(12)产量的方法。

酶法高通量测定发酵液中的腺苷含量

腺苷是合成阿糖腺苷、腺苷酸（AMP）、三磷酸腺苷（ATP）的主要原料,是一种重要的医药原料。目前,微生物发酵生产腺苷越来越受到重视,会产生大量的发酵液样品需要检测。基于腺苷脱氨酶（ADA）建立了一种快速、高通量检测发酵液腺苷的方法。实验结果表明,响应面方法优化检测试剂浓度为碳酸钠-碳酸氢钠34.20mmol/L-27.40 mmol/L,亚硝基铁氰化钠3.35 g/L,次氯酸钠的有效氯为0.172 5%,百里香酚6.64 g/L。该方法检测灵敏,检测限为0.025-6 mmol/L,能够满足发酵检测和高通量筛选的需要。

二硫化钼基纳米复合材料的构筑与应用

二硫化钼(Mo S_2)具有典型的层状结构,易于形成寡层Mo S_2纳米片,具有丰富的光、电、催化性能,在光电信息与能源转换等领域有广泛应用潜力.采用含钼化工原料并通过湿化学、气相沉积等方法制备寡层Mo S_2纳米片,继而构筑Mo S_2纳米片基功能纳米复合材料,是目前国内外的研究热点;但是,以化工钼试剂为原料制备Mo S_2纳米片的工艺路线长且不绿色.而辉钼矿是以层状Mo S_2为主要组分的矿物,在我国储量大,是制备寡层Mo S_2纳米材料的良好原料,因此,以经提纯处理的层状结构辉钼矿为直接原料,采用插层-剥离技术制备寡层Mo S_2纳米片是一种低碳经济途径.

常压室温等离子体(ARTP)诱变及高通量筛选维生素B_(12)高产菌株

采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)并从中筛选高产维生素B12突变株,确定等离子诱变最优处理时间75,s、输出功率100,W.通过流式细胞仪并结合核糖开关(riboswitch)感应元件检测其荧光值以初筛诱变后高产菌株,并利用48孔板高通量培养发酵,酶标仪快速检测维生素B_(12)产量,建立完整的诱变后高通量筛选体系.通过4轮ARTP诱变,筛选得到的突变株PA320-M4-1B1在250,mL摇瓶发酵6,d的条件下,维生素B_(12)产量达到(103.2±2.1)mg/L,较初始菌株PA320的(71.9±1.8)mg/L提高了43.8%,且遗传性状稳定.

双组份转运系统BrnFE的过表达和表面活性剂的添加对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸的影响

为了提高L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum LD320的产酸水平,通过改善其分泌系统,在C.glutamicum LD320中分别过表达突变型和野生型的双组份转运系统BrnFE操纵子,构建了重组菌LD320/p XMJ19-brn FE和LD320/p XMJ19-brnFE1。通过对两株重组菌的L-异亮氨酸生产分析比较,发现突变型比野生型能更有效地提高L-异亮氨酸产量。同时对LD320/p XMJ19-brnFE1进行表面活性剂添加实验,发现Tween-80为最佳选择,其最佳添加量为0.5 g/L,最佳添加时间为对数期的16 h。最后通过7 L发酵罐放大实验,LD320/pXMJ19-brnFE1的L-异亮氨酸产量由18.53 g/L提高到25.45 g/L,比对照组提高了37%。

D-生物素合成研究进展

D-生物素属于B族维生素,也是合成维生素C的必要物质,最初在酵母的研究过程中被发现,之后与其相关的报道层出不穷。在工业中,D-生物素以化学法合成,但化学法有工艺繁杂以及会对环境造成危害等弊端,而利用生物法合成D-生物素则有工艺简单和环境友好等优点,因此近些年通过微生物合成D-生物素的研究越来越广泛。该文综述了D-生物素的生理作用、化学合成法、生物合成法以及微生物合成D-生物素的研究进展,旨在为以后研究者们对微生物合成D-生物素的研究提供参考。

毒素蛋白基因mazF在基因修饰系统中的应用进展

毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA系统)存在于大部分细菌中。mazEF是大肠杆菌中一种毒素-抗毒素系统。毒素基因mazF编码的MazF毒素蛋白可以特异性地剪切自由mRNA的ACA序列,从而抑制蛋白合成、引起细胞生长停滞;近些年,许多学者利用mazF基因作为反向筛选标记对不同种微生物建立了无标记或无痕的基因修饰系统,并实现了不同菌株的基因组修饰。主要综述了大肠杆菌mazF基因作为反向筛选基因的应用原理及其在不同种类微生物的基因修饰系统中的应用进展,然后对mazF基因及其他毒素基因在基因修饰系统中的应用进行了展望。

通过信号肽筛选优化耐高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌

以大肠-枯草穿梭载体p MA5质粒为基本骨架,以来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus NUB3621的耐高温α-淀粉酶基因为目标基因,利用POE-PCR法,成功构建针对淀粉酶的信号肽筛选载体。从枯草芽孢杆菌168基因组中扩增得到46个信号肽,利用POE-PCR法,使46个信号肽分别与线性化的筛选载体形成对应的multimer产物,直接转化枯草芽孢杆菌1A751,得到含不同信号肽的重组菌株。发酵结果显示,除了5个与淀粉酶适配性很低的信号肽,其它信号肽均有不同的引导淀粉酶细胞外分泌的能力,其中bgls引导淀粉酶细胞外分泌的能力最强,上清酶活的峰值达1 393.3 U/m L。

L-丝氨酸检测技术的研究进展

L-丝氨酸作为一种非必需氨基酸,它在药物、化工产品以及食品等方面得到了广泛应用,是一种重要的工业产物,具有很重要的研究价值。快速、准确、高通量的检测L-丝氨酸含量的方法,能够为高通量菌种选育提供坚实的基础。本文介绍了目前检测L-丝氨酸含量的多种方法,包括变色酸-分光光度法、纸层析-分光光度法、荧光猝灭法、茚三酮显色法、高效液相色谱法、酶反应检测法及毛细管电泳-电致化学发光(CE-ECL)法,同时通过比较它们的优缺点,并针对L-丝氨酸检测中存在的各种问题进行讨论分析,对L-丝氨酸的检测技术进行展望。

响应面法优化腺苷脱氨酶法快速检测发酵液中的腺苷含量

通过腺苷脱氨酶（ADA）与靛酚蓝方法结合建立一种高通量快速检测腺苷的新方法。通过单因素、响应面方法优化氢氧化钠、水杨酸、亚硝基铁氰化钠和次氯酸钠的用量,并进行了验证,以最优试剂用量建立腺苷的标准曲线。确定了检测腺苷的最优试剂用量氢氧化钠25.85g/L、水杨酸68.05g/L、亚硝基铁氰化钠2.19g/L和次氯酸钠40.9m L/L,该方法线性范围为0.01～10mmol/L,加标回收率在95.5%～103.8%之间,RSD精准度在0.9%～3.3%之间。本方法与HPLC法检测发酵液中的腺苷含量结果一致。本方法可以用来快速、高通量的检测发酵液中的腺苷含量。

苜蓿中华根瘤菌代谢组学样品制备方法的研究

代谢组样品制备是代谢组学研究的基础。本文以维生素B12生产菌株苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 320为研究对象,通过检测细胞损伤、ATP泄漏、代谢物回收效率以及细胞代谢淬灭效率综合评价细胞淬灭方法,同时对5种提取试剂的提取效率进行比较优化胞内代谢物的提取方法。最终获得苜蓿中华根瘤菌S.meliloti 320的胞内代谢组学样品制备较佳条件:即-20℃40%甲醇淬灭细胞,过滤收集淬灭细胞,甲醇/乙腈/水(体积比为2∶2∶2,外加0.1%的甲酸)与50%甲醇相结合提取胞内代谢物。实验结果显示-20℃的40%甲醇(通过过滤收集细胞)对细胞膜的损伤较小,且细胞代谢淬灭效率和回收效率较高;甲醇/乙腈/水(体积比为2∶2∶2,外加0.1%的甲酸)与50%的甲醇对胞内代谢物的提取效率较高且有互补作用。

不同来源的尿卟啉原Ⅲ转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B_(12)的影响

S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖型尿卟啉原Ⅲ转甲基酶(S-adenosy-L-methionine uroprophyrinogen Ⅲ methyltransferase,SUMT)催化尿卟啉原Ⅲ(uroprophyrinogen Ⅲ,urogen Ⅲ)中心碳原子C-2和C-7甲基化生成前咕啉-2,是维生素B_(12)生物合成途径中的一步关键酶。本文分别克隆了荚膜红细菌来源的RCcob A1,RCcob A2和脱氮假单胞菌来源的PDcob A,并在VB_(12)生产菌株脱氮假单胞菌中过表达和发酵。通过对三株重组菌维生素B_(12)发酵结果分析可知,SUMT(PDcob A),SUMT1(RCcob A1)和SUMT2(RCcob A2)的表达有利于维生素B_(12)产量的提高,与对照菌株相比分别提高了16.48%,10.2%和31.86%。根据摇瓶发酵的结果在5 L发酵罐上进行了放大实验,p BBR122-PblaRCcob A2的产量为144.5 mg/L,相比对照菌p BBR122-Pbla(111.3 mg/L)产量提高了29.83%左右。结论:SUMT的表达可以在一定程度上解除维生素B_(12)合成途径中的瓶颈,提高维生素B_(12)产量。

DNA碱基编辑器在微生物中的研究进展

在众多生物中利用具有切割作用的CRISPR/Cas9系统与非同源性末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)修复系统或同源性末端连接(homology-directed repair,HDR)修复系统共同完成基因编辑工作都有报道。但是由于NHEJ的不精确性以及一些微生物中HDR效率较低导致生物体死亡限制了该工具的发展。基于CRISPR/dCas9系统构建而成的DNA碱基编辑器作为一种编辑工具,可靶向地实现碱基之间的转换,且不导致微生物死亡。DNA碱基编辑器在微生物中已经实现靶向编辑工作,可以同时多个位点进行编辑,同时可以利用该工具将编码氨基酸的密码子转化为终止密码子,提前终止翻译过程实现对基因的失活。本文主要对DNA碱基编辑器的作用原理,发展历程以及在微生物中的应用做了概述,最后提出了该工具存在的一些不足之处,并结合相关研究展望了未来的研究方向。为在微生物中开发与利用DNA碱基编辑的研究提供了思路。

CRISPR/dCas9在苜蓿中华根瘤菌中的建立与应用

本文探讨了CRISPR/dCas9系统对苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 320内源hemE基因的弱化效果,以提高其维生素B 12的能力。实验首先验证了CRISPR/dCas9系统及CRISPR/dCas9系统不同N20靶向位点在S.meliloti 320中对外源基因gfp的弱化效果。结果显示,当添加诱导剂1%木糖时,单位OD荧光值降低为对照菌株的34.18%,当N20靶位靠近翻译起始位点时,对结构基因弱化效果明显。进一步探究CRISPR/dCas9对S.meliloti 320中内源的弱化效果发现,在加入终浓度为1%木糖诱导后,hemE基因的转录水平与对照相比下降了28.3%。将hemE基因弱化后的工程菌进行摇瓶发酵,其维生素B 12产量较对照株提高了9.86%。研究结果显示,hemE基因的弱化有效促进了代谢流引向维生素B 12合成,CRISPR/dCas9系统对S.meliloti 320内源结构基因具有较好的弱化效果。

SiC-MoSi2涂层C/C复合材料的动态氧化行为研究

C/C复合材料在使用过程中往往经受急冷急热与高温燃气冲刷。为了研究涂层C/C复合材料的动态氧化行为及失效机制,本文对SiC/MoSi 2涂层C/C复合材料试样的全温抗氧化性能以及抗冲刷性能进行测试分析.结果表明:SiC/MoSi 2涂层试样具有良好的高温抗燃气氧化冲刷性能,在经历1600℃高温燃气冲刷55.5 h,10次室温~1600℃~室温急冷急热考核后,失重率仅为7.68%;涂层试样在高温风洞中动态氧化失效的原因是位于缺陷氧化最敏感温度处的试样微区的氧化损耗最为严重,导致试样在该微区处的力学性能显著下降,使其无法承受气动载荷而发生断裂.

炉压和试样位置对CVD⁃SiC涂层组织与抗热疲劳性能的影响

带有SiC涂层的石墨基体可以有效解决石墨材料在高温、腐蚀性气体环境中的腐蚀掉粉问题。在石墨基体表面制备碳化硅涂层,通过调整优化各项沉积工艺参数,以期达到快速制备高性能SiC涂层的目标,为其在石墨基体表面的应用提供理论基础和技术支持。以甲基三氯硅烷(MTS)、H_(2)为原料,使用工业级化学气相沉积设备在石墨基体表面制备碳化硅涂层,结合扫描电镜、X射线衍射仪、真空热循环等分析测试方法,研究了炉压和试样位置对涂层组织结构和抗热疲劳性能的影响规律。结果表明:炉压为2.0 kPa时可以制备出晶粒生长取向性单一且高纯的碳化硅涂层,随着炉压增大,涂层沉积速率和抗热疲劳性能均呈现出先升后降再升的非单调性变化,其中炉压为2.0 kPa时碳化硅涂层的沉积速率最快且其热疲劳性能最好;不同试样位置时制备的涂层均为纯的SiC涂层,试样悬挂位置距离布气盘越近时涂层沉积速率越快,且其抗热疲劳性能越好。炉压为2.0 kPa、试样位置为300 mm时可快速制备出抗热疲劳性能良好的SiC涂层。

荚膜红细菌尿卟啉原Ⅲ转甲基酶的纯化及其酶学性质

S-腺苷-_L-甲硫氨酸依赖型尿卟啉原Ⅲ转甲基酶(S-adenosy-_L-methionine uroprophyrinogenⅢmethyltransferase,SUMT)催化尿卟啉原Ⅲ(UroprophyrinogenⅢ,urogenⅢ)的中心碳原子C-2和C-7位上甲基化生成前咕啉-2,是维生素B12生物合成途径中的一步关键酶,但大部分SUMT受其底物urogenⅢ和副产物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosy-_L-homocysteine,SAH)的抑制作用。为了挖掘能耐受高浓度urogenⅢ的转甲基酶,文中从荚膜红细菌Rhodobacter capsulatus SB1003中克隆2个SUMT基因(RCcobA1,RCcobA2),经表达与纯化后,检测发现RCcobA1和RCcobA2的酶活分别为27.3 U/mg和68.9 U/mg,后者比VB_(12)工业生产菌株脱氮假单胞菌Pseudomonas denitrificans中内源的SUMT(PDcob A,27.9 U/mg)高2.4倍,并且当urogenⅢ浓度高达70μmol/L时都几乎不受抑制作用。因此,RCcobA2的发现可以为解除VB_(12)合成途径的瓶颈以及提高VB_(12)产量提供理论支持和方向指导。

建筑给排水施工中的常见问题及对策探讨

近年来随着工程规模和数量的持续增加,给排水工程渗漏问题的存在,在缩短工程使用寿命的同时,也给居民正常生产生活造成了极为不利的影响。 鉴于此,文章通过剖析城市给排水工程设计施工中的缺陷,对其处理技术进行了深入探析,以此在提高工程施工质量和施工效率的同时,为国家的可持续发展创造良好条件。