基于TCID_(50)检测AAV9载体制品感染性滴度的方法

目的:建立一种基于半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID50)检测9型腺相关病毒(adeno-associated virus type 9,AAV9)载体制品感染性滴度的方法。方法:利用含AAV2 rep和cap基因的1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type1,HSV1)做为辅助病毒与梯度稀释的AAV9载体制品共同感染HEK-293细胞,培养48 h后用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)扩增AAV特异性反向末端重复序列(inverted terminal repeats,ITR),根据阳性及阴性感染孔数,利用Krber法计算样品的TCID50。结果:采用携带增强绿色荧光蛋白报告基因的AAV9载体制品确定辅助病毒HSV1-rc最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5,AAV9-101的感染性滴度为1.6×109TCID50/m L。结论:对AAV9载体制品进行感染性滴度检测,且具有可重复性。

高通量miRNA活性谱检测发现BHK21细胞中miR-206高活性

用我们建立的活细胞miRNA活性谱检测技术测定BHK21、HEK293和Vero三种肾来源细胞系中58种miRNA活性谱,发现miR-206在BHK21细胞中具有特征性高活性。鉴于miR-206是典型的横纹肌特征性miRNA,进一步以小鼠成肌细胞C2C12及人胚肾细胞HEK293为对照,检测了BHK21细胞中miR-206的活性及表达水平。之后,用马血清诱导培养BHK21细胞,检测诱导前后BHK21细胞中骨骼肌肌球蛋白重链(Slowskeletal myosin heavy chain,MHC)表达情况,miR-206活性和表达水平以及受miR-206负调控的Connexin43(Cx43)的表达水平。结果发现,miR-206在BHK21细胞中活性和表达水平都明显高于C2C12细胞;马血清诱导后,BHK21细胞中MHC表达水平升高,miR-206活性和表达水平都升高,而Cx43表达水平下降。结果提示BHK21细胞具有成肌细胞特性。本研究首次发现BHK21细胞中miR-206的高活性,从miRNA角度证实了BHK21细胞来源于肾间质细胞,而不是肾实质细胞。研究结果还提示BHK21细胞有可能作为一种体外模型用于miR-206的功能研究。

AAV载体介导的蓬佩病模型小鼠体内基因治疗研究

目的:蓬佩病是一种由酸性α-葡糖苷酶(GAA)缺乏引起的溶酶体糖原贮积症,病理特征是糖原在心脏、骨骼肌和中枢神经系统中累积。基因治疗有望成为治疗蓬佩病的突破性手段。采用AAV9载体在蓬佩病模型小鼠体内介导GAA基因转移,评估转基因干预后小鼠体内GAA酶活力变化、组织糖原累积及病理改变。方法:采用AAV9载体携带密码子优化的GAA基因(coGAA),通过杆状病毒生产工艺包装AAV病毒载体rAAV9-coGAA,分别以1.1×10^(13)vg/kg、3.0×10^(13)vg/kg、1.2×10^(13)vg/kg的剂量静脉单次注射给予成年蓬佩病模型小鼠,以3.0×10^(14)vg/kg的剂量静脉单次注射给予老龄蓬佩病模型小鼠。到达试验终点后安乐死小鼠,使用荧光分光光度法测定GAA酶活力、PAS染色观察糖原累积、HE染色检查病理变化。结果:成年模型小鼠给药5周后,各个组织能够广泛表达具有活性的GAA,其中心脏、肝脏表达水平较高,脑和脊髓表达水平较低。转基因干预后心肌、骨骼肌与脑中的糖原含量下降,心肌、骨骼肌的空泡样变性显著减少。老龄小鼠治疗后,组织酶活力与模型小鼠相比显著提升,心肌的空泡样变性和炎细胞浸润减少,但骨骼肌的病理改善有限。结论:静脉单次注射rAAV9-coGAA在蓬佩病模型小鼠中能够提升GAA酶活力,减少糖原累积并改善病理,治疗效果呈剂量依赖,对老龄小鼠也有一定治疗效果。为AAV9静脉递送GAA基因治疗蓬佩病的临床应用奠定了基础。

携带CAR启动子的重组AAV9病毒在小鼠体内表达分布特性研究

基因治疗正日益成为罕见病乃至单基因遗传病的首选治疗策略,提升基因药物的体内表达是重要研究领域。本文选择4种短内含子构建了4种嵌合型启动子CAR、CAS、CAP、CAT,通过Gluc报告基因表达活性比较发现,CAR强度明显高于CA,仅次于CAG。选择CAR启动子构建和制备了携带EGFP报告基因的重组病毒rAAV9-CAR-EGFP,经SDS-PAGE分析可见病毒外壳蛋白条带清晰,表明纯度良好;Southern杂交检测可见基因组以自身互补的双链DNA为主。在新生小鼠和成年小鼠中用静脉注射(IV)和侧脑室注射(ICV)两种途径给药,研究了rAAV9-CAR-EGFP的体内表达分布特性。结果表明,新生鼠ICV注射rAAV9-CAR-EGFP在其脑部和脊髓可以观察到EGFP高转导效率和高强度表达,新生鼠IV注射rAAV9-CAR-EGFP可在脑组织观察到明确的EGFP绿色荧光,表明该病毒可有效穿越血脑屏障,但IV注射对于中枢神经系统的转导效率和表达强度明显低于ICV注射。无论是IV注射还是ICV注射,神经和肌肉系统中都可观察到EGFP的持续表达;同时还可以观察EGFP蛋白在外周组织中广泛分布,其中以肝脏、骨骼肌和心肌最为显著。另外,成年鼠IV注射rAAV9-CAR-EGFP可在肝脏观察到EGFP持续表达,而新生鼠IV或ICV注射则肝脏中EGFP的表达会随动物生长而明显衰减。这些研究结果为我们下一步用AAV9携带CAR启动子介导目的基因表达治疗中枢神经系统疾病如脊髓性肌萎缩症的基因药物设计奠定了基础。

生物样本中9型腺相关病毒结合抗体ELISA检测方法的建立和评价

建立生物样本中9型腺相关病毒(Adeno⁃associated virus type 9,AAV9)结合抗体的体外检测方法,验证该方法的临界值、灵敏度、精密度、特异性和药物耐受性指标。建立间接酶联免疫吸附方法(Enzyme⁃linked immunosorbent assay,ELISA),用健康人血清、AAV9载体基因药物干预的小鼠免疫血清对方法的关键性能进行验证。该检测方法对人血清样本的筛选临界值(Screening cut point,SCP)是1.50,滴度临界值(Titer cut point,TCP)是2.46,确证临界值(Confirmation cut point,CCP)是45.75%,灵敏度是75.79 ng/mL,批间精密度变异为7.28%。未检测到5μg/mL的抗AAV5小鼠单抗、抗AAV8小鼠单抗特异性结合AAV9载体。高、中、低浓度的质控样品均可耐受AAV9病毒颗粒的药物浓度为1×109 CP/mL。检测5只给药小鼠血清,给药前血清AAV9结合抗体筛选阴性;给药后28d血清抗体筛选阳性;再经确证实验,28 d血清8000倍稀释后,AAV9病毒颗粒抑制率均>CCP,为确证阳性;测得抗体滴度是1∶128000~1∶256000。本研究建立的AAV9结合抗体ELISA检测方法符合《药物免疫原性研究技术指导原则》要求,可用于以AAV9为载体的基因药物临床试验样本中AAV9结合抗体的检测。