鸡蛋暗斑对蛋品质及抗氧化能力的影响

[目的]研究鸡蛋暗斑对蛋品质及其抗氧化能力的影响。[方法]从饲喂同种日粮、饲养环境相同、同日龄褐壳蛋鸡同一批次所产的褐壳蛋中,用灯光照射法挑选出24枚典型正常蛋、24枚典型暗斑蛋进行试验,并分别对正常蛋和暗斑蛋进行蛋品质、蛋黄抗氧化指标的测定及比较。[结果]蛋品质比较:暗斑蛋与正常蛋相比,其蛋形指数、蛋壳强度、蛋重、哈氏单位、蛋白高度、鸡蛋等级、蛋黄颜色、蛋黄重、蛋壳重、蛋清重、蛋壳厚度、蛋黄比重、蛋壳比重、蛋清比重均差异不显著(P>0.05);暗斑蛋蛋壳颜色极显著深于正常蛋(P<0.01)。抗氧化指标比较:暗斑蛋蛋黄的总抗氧化能力(T-AOC)显著低于正常蛋蛋黄的总抗氧化能力(P<0.05),暗斑蛋蛋黄的丙二醛(MDA)含量与正常蛋蛋黄的丙二醛含量相比差异不显著(P>0.05)。[结论]与正常蛋相比,暗斑蛋的蛋壳颜色较深,总抗氧化能力较差。

太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光定位

试验旨在研究太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光定位,采用细胞免疫荧光技术通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光情况。结果表明:①不同一抗浓度对Lcn5呈现荧光图像影响较大,浓度稀释比例越大,浓度越小,荧光阳性信号越弱,适宜的一抗浓度稀释比为1∶50;不同二抗浓度对Lcn5阳性信号无显著影响,荧光二抗稀释比例为1∶100时荧光更清晰。②激光共聚焦显微镜扫描结果显示,Lcn5在细胞核和细胞质中均有表达;细胞培养到4 h时Lcn5在细胞核中大量表达,出现较强的阳性信号,并且在视野下发现培养液中有颗粒状的阳性信号。综上所述,推测Lcn5可能在附睾头细胞培养的过程中在细胞内合成并分泌到细胞外,对附睾微环境的构建起到了作用,同时可能参与精子的成熟过程。

LCN5蛋白在雄性绵羊生殖器官及精子中的表达定位

【目的】探究绵羊附睾视黄酸结合蛋白——载脂蛋白5(lipocalin5,LCN5)在睾丸、附睾不同区段及输精管组织表达特点及其精子中的定位,为LCN5在雄性生殖器官中的功能研究提供理论依据。【方法】选择体重相近((65.23±1.95)kg)、体况良好、健康无病的9月龄公绵羊6只,其中3只使用假阴道法采集精液,3只做无菌去势。快速采集左侧睾丸(testis,T)、附睾输出小管(efferent ducts,ED)、附睾头(caput,E1-E2)、附睾体(corpus,E3-E5)、附睾尾(cauda,E6-E7)及输精管(vas deferens,VS)组织样分别置于液氮和4%多聚甲醛中。使用计算机辅助精子分析仪检测精液中精子、从右侧睾丸、附睾不同区段及输精管中分离出精子的运动学参数;利用Western blot技术和免疫组织化学法检测睾丸、附睾不同区段及输精管中LCN5蛋白表达;采用精子免疫荧光观察睾丸、附睾不同区段及输精管中精子LCN5定位及分布。【结果】(1)精子运动学参数结果表明:附睾尾部和射出精子A级、C级精子数、VAP、VSL、VCL、ALH、BCF、WOB、LIN和STR均显著高于其他区段(P<0.05)。输精管精子中A级精子百分比、VAP、VSL、WOB、LIN均显著高于输出小管,附睾头和附睾体段(P<0.05)。然而,睾丸精子完全无运动能力。(2)Western blot结果显示LCN5在附睾头E1区段表达量最高,在附睾头E2区段、附睾尾E6区段表达量高于附睾体、睾丸和输出小管(P<0.05),定量分析结果显示LCN5蛋白表达量从高到低为:E1>E2>E6>E3≈E5≈E4≈E7>VS>ED>T。(3)睾丸、附睾不同区段及输精管LCN5免疫组化结果表明,LCN5蛋白定位于睾丸长形精子细胞中,在ED主细胞和基底细胞中有微量表达,附睾头、附睾体和附睾尾主细胞、基底细胞及纤毛中大量表达并出现强阳性信号,管腔有颗粒状LCN5信号分散在精子聚集区内;输精管平滑肌细胞中也出现了较弱LCN5阳性信号。(4)睾丸、附睾不同区段及输精管中精子LCN5免疫荧光结果显示,LCN5在睾丸和输出小管精子顶体帽和中段中有微弱信号,在附睾头E1区段中精子顶体前端及尾部中段出现了强阳性信号。精子鞭毛上原生质滴中也有LCN5表达;精子运行到E6区段时,部分精子头部全部被包裹、原生质滴脱落完成成熟,但有些精子尾部仍有原生质滴,直到附睾尾E7区段原生质滴完全脱落。精子表面LCN5在附睾尾和体区段的表达模式与附睾头区段类似。【结论】LCN5蛋白在绵羊雄性生殖器官组织中区域性表达,高度表达在附睾头中,聚集在附睾尾E6区;LCN5蛋白在附睾头、附睾体、附睾尾及输精管的精子表面、鞭毛原生质滴中呈动态分布,这也表明其在精子成熟过程中的潜在功能。总之,LCN5可能在精子发生、成熟、贮存方面发挥重要作用,这也为后续LCN5的功能研究及其开发利用提供了理论参考。

β防御素124沉默通过p38MAPK/AP1通路调控山羊附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达

旨在研究山羊β防御素124(goat beta-defensin 124,gBD124)沉默对p38MAPK/AP1通路及下游细胞趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将设计的3条gBD124-shRNAs载入LV10-U6/RFP&Puro质粒载体,与包装质粒共转染到293T细胞中,用梯度稀释法测定病毒原液的滴度;将构建的3个LV10-gBD124和LV10-gBD124-NC载体转染到山羊附睾头细胞中,筛选有效沉默载体;然后用有效沉默载体联合转染附睾头细胞,设置了空白细胞对照组、LV10-NC组、有效沉默载体组,用2μg·mL^-1嘌呤霉素筛选后分别收集细胞和培养液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA检测gBD124、MAPK信号通路关键蛋白、细胞因子及趋化因子基因及蛋白表达情况。本研究构建了gBD124沉默慢病毒载体,筛选出LV10-gBD124-51和LV10-gBD124-161两个有效载体,并成功构建了gBD124沉默稳定转染的附睾头细胞株。与NC对照组相比,gBD124沉默显著降低了山羊附睾头细胞MAPK通路中MAPK1以及AP1的两个亚型c-JUN和c-FOS基因表达(P<0.05),显著增加了RASA1基因表达(P<0.05);gBD124沉默显著降低了总p38MAPK、总c-JUN和总c-FOS蛋白表达,以及磷酸化p38MAPK和c-JUN蛋白表达(P<0.05);gBD124沉默显著上调了MAPK通路下游IL-1β及其受体IL-1R2、IL-8和趋化因子CCL6和CCL21基因表达(P<0.05),下调了CCL5和IL-1α基因表达(P<0.05);gBD124沉默显著降低了细胞培养液中CCL5浓度(P<0.05)。与空白对照组相比,gBD124沉默显著增加了培养液中IL-1β和IL-8浓度,降低了IL-1α浓度(P<0.05)。gBD124基因沉默通过抑制p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达。

幼龄和成年太行山羊附睾头差异竞争性内源RNAs机制分析

旨在筛选出幼龄和成年太行山羊附睾头中差异表达的长链非编码RNAs(lncRNAs)、微小RNAs(miRNAs)和mRNAs,构建太行山羊附睾头中免疫相关基因调控的竞争性内源RNAs(ceRNAs)网络。本研究选取健康状况良好、体重相近的幼龄(2月龄)和成年太行山羊(2周岁)公羊各3只,去势采集其附睾头组织进行全转录组测序,用DESeq2软件筛选出幼龄和成年太行山羊附睾头差异mRNAs、lncRNAs和miRNAs。利用miRanda软件和R-package(reshape2、dplyr、tidyr),基于ceRNA-score原理分析得到差异ceRNAs表达谱,对预测所得具有ceRNAs关系的mRNAs进行GO和KEGG富集分析,并绘制得到太行山羊附睾头免疫相关ceRNAs网络。最后,各随机挑选8个mRNAs、miRNAs和lncRNAs,并通过qRT-PCR验证全转录组测序结果的准确性。根据分析结果,以幼龄太行山羊附睾头为对照,成年山羊附睾头差异表达mRNAs有6461个,其中上调2997个、下调3464个;差异表达lncRNAs共有1147个,其中703个上调、444个下调;差异表达miRNAs共有182个,其中81个上调、101个下调。共得到具有ceRNAs调控关系的lncRNAs 366个,其中上调213个,下调153个;mRNAs有3131个,其中1253个上调,1878个下调;miRNAs有140个,其中48个上调,92个下调。分析具有ceRNAs机制的基因发现,表达量显著上调的与免疫相关的mRNAs:淋巴细胞抗原6复合位点蛋白G5B(LY6 G5B)、脂质运载蛋白9(LCN9)、解整合素金属蛋白酶28(ADAM28)和粘蛋白15(MUC15)基因在成年太行山羊附睾头表达量高,且极显著高于幼龄太行山羊(P<0.01)。GO和KEGG富集分析表明,具有ceRNAs机制的差异表达基因富集在内质网蛋白加工通路、蛋白质输出通路、粘蛋白型O-聚糖生物合成通路、细胞外基质受体相互作用通路等。qRT-PCR验证结果表明,除chi-miR-320-3p外,其余差异表达的mRNAs、lncRNAs和miRNAs表达趋势与全转录组测序结果一致。附睾头免疫相关ceRNAs网络分析表明,lncRNA-MSTRG.22929.11、lncRNA-MSTRG.57822.5、lncRNA-MSTRG.26758.1、lncRNA-MSTRG.12113.3、lncRNA-MSTRG.59930.2等lncRNAs作为ceRNAs可以调控附睾头免疫相关基因表达。本研究筛选出了幼龄和成年太行山羊附睾头差异ceRNAs,挖掘并绘制了免疫相关的关键ceRNAs网络,这些lncRNAs作为ceRNAs可为太行山羊附睾头免疫调控机制研究提供参考依据。