2020年~2021年我国副猪嗜血杆菌和链球菌的血清型、耐药基因型流行情况分析

为了解我国副猪嗜血杆菌(HPS)和猪链球菌(SS)血清型的流行趋势,本研究利用PCR对2020年~2021年国内分离的52株HPS和69株SS分别检测二者的血清型;通过查阅2014年~2020年国内外文献报道的402株HPS和189株SS的血清型,并与上述分离的HPS、SS的血清型作比较,分析二者血清型的流行趋势。结果显示,2020年~2021年HPS主要优势血清型占比由高到低依次为12>4=5>13型,SS主要优势血清型占比由高到低依次为2或1/2>5>不确定型(US)>8=18>27>15型;文献检索结果显示:2014年~2020年HPS主要优势血清型占比从高到低依次为4>5>US>13>14>7型,SS主要优势血清型为2或1/2>7>9>US。表明血清4、5、13型仍是HPS的优势血清型,且12型升高了28%;血清2或1/2仍然是我国SS的优势血清型,且5、15、18、27型明显增加,7和9型减少,US型仍然较高。采用K-B法检测HPS与SS分离株的耐药性,采用PCR检测二者的耐药基因(7大类共27种耐药基因),并分析二者的耐药基因与耐药表型的相关性。药敏试验结果显示,两类分离菌中对β-内酰胺类、大环内酯类和磺胺类药物耐药的菌株高达88.31%(68/77),对氨基糖苷类和四环素类药物耐药的菌株分别约为80.52%(62/77)和76.62%(59/77),对酰胺醇类和喹诺酮类药物耐药的菌株较少。且二者均存在严重的多重耐药性,其中双重耐药的菌株占比最高为28.57%(22/77),4重、5重、6重及8重耐药的菌株均为14.29%(11/77)。耐药基因检测结果显示,两类细菌均检出了β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类和Ⅰ类整合子4大类耐药基因,特别是β-内酰胺类的bla-TEM、磺胺类的sulI耐药基因检出率均为100%。其中100%HPS分离株检出氨基糖苷类的Aph(3’)-Ia、Ⅰ类整合子的3’CS和Int1耐药基因;100%SS分离株检出Ⅰ类整合子的VR耐药基因。两株菌耐药基因与耐药表型相关性分析结果显示,β-内酰胺类和磺胺类耐药表型与耐药基因之间的符合率达88%;氨基糖苷类耐药表型与耐药基因之间的符合率为72%;四环素类和喹诺酮类耐药基因和耐药表型之间不符合。上述结果表明,HPS和SS分离株的耐药性均较强,且其部分耐药表型与其携带的耐药基因相关性较强。本研究为规模化养殖场HPS和SS感染的临床用药及疫苗研发提供了数据支持,并为后续相关疾病的防控奠定了基础。

石墨烯/二硫化钼纳米复合材料的研究进展及应用

近几年来石墨烯/聚合物复合材料随着石墨烯材料的研究的兴起,迅速在电子原件、物理、化学、生物诸多方面引起学者的广泛关注。综述了石墨烯/二硫化钼纳米复合材料的研究进展和应用。简单叙述了石墨烯和二硫化钼的性能、结构和制备工艺,介绍了石墨烯/二硫化钼纳米复合材料的制备和性能以及最新的研究进展和应用。

2015年~2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒S1蛋白关键表位的变异分析

为了解2015年~2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行特征和遗传变异规律,本研究利用RT-PCR扩增2015年~2017年11株分离自浙江地区PEDV流行株的S1基因序列,并与GenBank中我国东部地区(上海、江苏、山东、河南和安徽)的86株PEDV流行株的S1基因序列通过MEGA 7.0软件比较分析S1基因的遗传进化关系,采用CLC Sequence Viewer 8软件分析比对S1蛋白氨基酸序列的变异。PEDV S1基因遗传进化分析结果显示,97株PEDV中有92%的流行株属于G2型,与疫苗株CV777同源性较低(90.4%~96.1%),山东地区2017年~2018年间的部分流行株与疫苗株CV777等属于G1型;G2型中,33%的流行株属于G2a型,67%的流行株属于G2b亚型,其中2019年~2021年的流行株有15%流行株属于G2a亚型,85%的流行株属于G2b亚型。S1蛋白关键表位的变异分析结果显示,与经典株CV777相比,中和表位COE(CO-26K equivalent epitope)发生8个氨基酸位点(A^(517)S、S^(523)G、V^(527)I、T^(549)S、G^(594)S、A^(605)E/D、L^(612)F/Y、I^(635)V)的突变,SS2区域无氨基酸变异,SS6发生1个氨基酸位点(Y^(766)S)的突变,2018年后出现新的突变位点(T^(636)I和S^(749)G)。不同地区S1蛋白关键表位的变异分析结果显示,aa501变异在河南地区(L^(501)P)和江苏地区(L^(501)W)存在明显的差异;aa536突变(F^(536)L)多集中于河南、山东地区的流行株,aa542突变(D^(542)E)集中于江苏、上海地区。本研究首次系统分析了我国东部地区PEDV流行株S1基因及其氨基酸的遗传变异规律,为我国该地区PEDV变异株疫苗选择、生物安全防控方案制定提供了参考依据。

杭州规模化猪场两种通风模式下育肥舍内环境因子的比较分析

【目的】研究两种通风模式下杭州地区规模化猪场舍内环境参数及其分布规律,筛选出适合本地区推广的通风模式。【方法】选取杭州地区具有代表性的横向通风和纵向通风两种通风模式下育肥舍为研究对象,开展了早、中、晚3个不同时间点,进风口、舍中央和排风口3个不同位置的热环境参数、有害气体浓度的监测,持续监测1周。分析不同时间点和舍内不同位置对热环境参数(温度、相对湿度、风速)以及有害气体(氨气(NH3)和硫化氢(H2S))浓度的影响,并对两种模式下的热环境参数及有害气体浓度进行比较分析;采用空气沉淀法收集舍内环境中的细菌,并对细菌进行培养及统计分析,比较两种模式下育肥舍中细菌数量差异。【结果】两种通风模式下育肥舍相对湿度均低于国家标准,位置和各时间点对相对湿度影响不大,其中纵向通风舍内的相对湿度显著高于横向通风模式(P<0.05)。两种通风模式舍内平均温度没有显著性差异(P>0.05),舍内中午温度显著高于早、晚(P<0.05),位置对纵向通风舍内温度影响较大。纵向通风舍内平均风速为(1.09±0.42)m/s,符合国家标准且极显著高于横向通风模式(P<0.01),风速受舍内位置的影响,各时间点对其影响不大。两种通风模式下猪舍空气环境中有害气体浓度均在国家标准范围内,但纵向通风舍内NH3和H2S浓度均显著低于横向通风模式(P<0.05),各时间点H2S、NH3浓度差异均不显著(P>0.05),舍内不同位置对有害气体浓度分布影响较大,进风口位置有害气体浓度显著低于舍中央位置和排风口位置(P<0.05)。纵向通风舍内空气中细菌总数符合国家标准且显著低于横向通风模式(P<0.05)。【结论】纵向通风模式下育肥舍内的总体环境优于横向通风模式,在本区域生产应用中,育肥舍的设计倾向于推广纵向通风模式。

2021年浙江省部分地区猪圆环病毒2型及3型的遗传变异分析

为了解2021年中国浙江省各地区猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的遗传变异情况,本研究采用PCR技术对不同地区来源的702份病料样品检测。选取10个PCV2阳性样品进行全基因序列扩增和同源性及遗传演化分析。同时对已测序的26个PCV2 ORF2基因和24个PCV3 ORF2基因分别进行同源性分析,以及对Cap蛋白氨基酸序列进行比对分析。结果显示,病料样品中PCV2的总阳性率为32.8%(230/702),PCV3的总阳性率为15.0%(105/702)。其中PCV2在血清样品中的检出率最高,而PCV3在粪便样品中的检出率较高。PCV2和PCV3混合感染血清阳性率为6.1%(33/539),且仅在血清样品中有混合感染。测序筛选后共获得6个PCV2全基因序列,其中5个全基因序列为1767 bp,1个为1708 bp。PCV2全基因序列与24个国内外PCV2参考株全基因序列相比,同源性为94.1%~98.9%。通过全基因遗传进化树显示,6个PCV2全基因有5个PCV2d亚型和1个PCV2b亚型。ORF2基因序列的同源性结果显示,PCV2与PCV2疫苗株的同源性为90.2%~95.3%;PCV3与PCV3参考株的同源性为99.2%~99.4%,与PCV2疫苗株的同源性仅为32%,可能影响PCV2疫苗的保护效力。通过ORF2编码的Cap蛋白氨基酸序列比对结果显示,本研究中的PCV2 Cap蛋白氨基酸序列有20处变异,其中R^(59)K、K^(63)R、A^(68)N、R^(89)L、S^(90)T、S^(121)T、T^(134)N、S^(169)R、E^(210)D的变异揭示了该地区PCV2b亚型正逐渐向PCV2d亚型转变。上述结果表明,浙江省部分地区的PCV2d亚型已成为主要的流行基因型,且PCV3与PCV2疫苗株同源性较低。本研究结果丰富了浙江省PCV的分子流行病学资料,为相应疫病的防控提供一定的参考依据。

两种启动子拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒ZJ-JX-2015株效率的比较研究

为比较不同启动子驱动的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强毒株ZJ-JX-2015感染性克隆拯救的各重组病毒的效率,本研究将ZJ-JX-2015株全基因组引入无义突变位点(C-G,形成Bst B I酶切位点)作为后期鉴定标签并分成4段经PCR扩增后,分别克隆至含CMV启动子的p SMART-BAC载体和含T7启动子的p WSK-29载体中构建感染性克隆质粒p SMART-BAC-CMV-r PRRSV和p WSK-29-T7-r PRRSV,经PCR及测序鉴定正确后将前者分别转染BHK-21和293T细胞;将后者转染BHK-21(T7)细胞。48 h后收集上述各细胞上清液接种Marc-145细胞并连续传10代。通过观察细胞病变(CPE),收集不同代次Marc-145细胞上清液经PCR及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定拯救的各重组病毒。将拯救的各重组病毒以MOI 0.1接种Marc-145细胞,通过测定不同时间各病毒上清液的病毒效价(TCID50)绘制生长曲线。结果显示,各细胞上清液[BHK-21、293T细胞及BHK-21细胞(T7)]在Marc-145细胞中传至第2代时均出现CPE;PCR及测序鉴定结果显示,各代次的各组Marc-145细胞上清液均能扩增到544 bp的目的片段,且均含遗传标记Bst B I酶切位点。IFA结果显示,上述各代次各组Marc-145细胞上清液接种的各细胞中均出现绿色荧光,对照Marc-145细胞无绿色荧光。上述结果表明,拯救了3株重组PRRSV:BHK-r JX15、293T-r JX15(分别转染BHK21及293T细胞所得)及T7-r JX15株[转染BHK-21(T7)细胞所得],且各病毒的遗传稳定性较强。测定各病毒TCID50并绘制各病毒生长曲线,结果显示,在各病毒的感染后期(感染后72 h),BHK-r JX15株的病毒效价显著高于亲本病毒(P<0.05),极显著高于T7-r JX15及293T-r JX15株(P<0.01);293T-r JX15的病毒效价极显著高于T7-r JX15株(P<0.01),但这两株病毒的效价又极显著低于亲本病毒(P<0.001)。且4株病毒的生长趋势基本一致。上述结果表明CMV启动子驱动的重组PRRSV(BHK-rJX15和293T-r JX15)复制水平高于T7启动子驱动的重组病毒(T7-rJX15),尤以CMV启动子驱动并通过BHK细胞拯救的重组病毒(BHK-rJX15)复制水平最高。提示,CMV启动子更适用于构建PRRSV的反向遗传操作系统。本研究为构建PRRSV反向遗传操作系统及其蛋白功能研究、新型疫苗的研发奠定了基础。

LncRNA调控病毒感染与复制机制进展

长链非编码RNA(lncRNA)是一类核酸片段200 bp~100 kb、无典型开放阅读框、不编码蛋白质、具有调节功能的非编码RNA,它广泛存在于各种生命体中,数量大,种类多。其调控细胞内生物学功能包括:参与DNA甲基化、基因组印记及染色质修饰、调控转录激活、干扰细胞核内物质运输、核酸降解等重要过程。lncRNA与病毒感染复制的关系主要表现为:一方面病毒抑制胞内lncRNA的表达,借助lncRNA的转录激活调控功能,引起靶细胞凋亡通路的激活,促进病毒复制;另一方面病毒利用胞内lncRNA表达,调控先天免疫、NF-κB信号、炎症信号通路,进而促进病毒复制和感染。本文总结lncRNA与病毒感染和复制之间的研究最新进展,为研究病毒致病或者免疫逃逸机制提供新的视角。

副猪嗜血杆菌的多重耐药性及氨基糖苷类耐药基因分子流行病学分析

为了解规模化猪场副猪嗜血杆菌(HPS)的耐药基因流行情况,对来自国内52株HPS分离株开展了耐药基因检测、药敏试验、氨基糖苷类耐药基因Aph(3')-Ia和StrB氨基酸序列的比对及分析。结果表明:HPS分离株含有多重耐药基因(β-内酰胺类,氨基糖苷类,磺胺类药和Ⅰ类整合子),其中bla-_(TEM)、Aph(3')-Ia、3'CS和Int1基因检出率为100%;HPS分离菌株对硫酸链霉素的耐药率高达75%。HPS分离菌株Aph(3')-Ia编码的部分氨基酸与除了已知HPS之外的6种细菌的氨基酸序列相同;HPS分离株JX-6 StrB基因编码的氨基酸序列与其他细菌差别较大,该菌株第18号位点StrB基因的ATP结合位点也发生了突变。本研究表明规模化养猪场HPS氨基糖苷类耐药基因Aph(3')-Ia和StrB携带率高,细菌耐药性的差异和耐药基因的改变可能是由一些特定的位点突变所导致。本研究为规模化养殖场HPS耐药基因变化规律研究和相关疾病的防控奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒YJH141分离株感染性克隆的构建及鉴定

为构建猪流行性腹泻病毒(PEDV)YJH141毒株的感染性克隆,本研究将该病毒全长基因组分为8段进行扩增,在病毒全长基因组的11467与11476位核苷酸处引入同义突变,构建SfiⅠ酶切位点作为遗传标记位点。以病毒基因组RNA为模板通过RT-PCR分别扩增各片段,随后将各片段分别构建至T载体中作为亚克隆质粒。各亚克隆质粒经测序鉴定正确后,分段连接至pBAC载体中构建YJH141全长cDNA克隆质粒,通过PCR及测序验证显示全长感染性克隆质粒构建成功,将其命名为pBAC-PEDV-YJH141。将鉴定正确的pBAC-PEDV-YJH141转染至293T细胞,转染后24h收取上清接种于Vero细胞并传代。通过观察细胞病变(CPE)、RT-PCR检测、Western blot检测及测序验证重组病毒的遗传标记位点共同验证重组病毒拯救成功,将其命名为rYJH141。通过空斑试验、间接免疫荧光试验(IFA)和病毒生长曲线探究重组病毒与亲本病毒的生长特性,结果表明YJH141及rYJH141具有相似的生长特性。本研究为探究PEDV复制及致病机制的研究提供了技术平台,同时为疫苗的研发奠定了基础。

BVDV感染对小鼠巨噬细胞IFN-β相关信号分子的影响

为了探究致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhealvirus,BVDV)对小鼠巨噬细胞IFN-β相关信号分子的影响,以0.1和3 MOI感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过RT-qPCR、Western blot、ELISA等方法检测小鼠巨噬细胞中TLR37/TLR7、IRF3/IRF7、STAT1、IFN-β、ISG15/OAS1和USP18/SOCS1等因子的转录和表达水平差异,并对巨噬细胞中BVDV拷贝数进行检测。结果显示BVDV可以进入巨噬细胞细胞内,但病毒拷贝数不能随时间而增长。BVDV进入小鼠巨噬细胞先后上调TLR3和下调TLR7的转录水平,继而显著上调IRF3和IRF7转录水平,并呈现一定的剂量依赖性。STAT1和IFN-β的转录和表达也随BVDV感染而显著升高,而且IFN-β表达量随BVDV的病毒量和感染时间而增加。发挥抗病毒活性的ISG15和OAS1转录水平在BVDV感染前期出现显著升高,感染后期恢复正常,同时在感染后期干扰素负性调节因子USP18和SOCS1转录水平显著升高。所以致细胞病变型BVDV可以感染小鼠巨噬细胞,但不能复制,但可以通过TLR3/7-IRF3/7激活IFN相关信号通路,并接受负性调节因子的调控。