人肺腺癌干细胞的分离及鉴定

目的:从人肺腺癌细胞株中分离及鉴定具有干细胞特征的高致瘤性癌干细胞。方法:采用磁性细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)技术将肺腺癌细胞分成多个亚群,然后应用流式细胞及RT-PCR技术检测干细胞相关标志表达,通过NOD-SCID小鼠移植评估其致瘤性。结果:在A549和SPC-A肺腺癌细胞中发现一个新颖的癌细胞亚群,此类癌细胞的表型特征为CD24+IGF-1R+,具有高侵袭性和高致瘤性,在NOD-SCID小鼠中仅需移植100个细胞即可形成肿瘤,其致瘤能力是上述标志阴性细胞的1000倍。此外,这些细胞表达胚胎干细胞标志(OCT4和Bmi-1)及肺干细胞标志(CCSP,SP-C,TTF-1和Gremlin),类似小鼠肺脏细支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cells,BASC),并具有自主生长特性,能够在无血清条件下长期培养。结论:人体肺腺癌中CD24+IGF-1R+细胞属于BASC样癌干细胞。

外周血循环中肺癌细胞的流式细胞仪定量分析

目的 运用流式细胞仪定量分析外周血循环中肺癌细胞。方法 外周血经Ficoll梯度离心分离单核细胞组分,后者用CD45、细胞角蛋白(CK)及肺癌特异性单抗(2F7/S5A)染色后,应用流式细胞仪检测CD45- CK+ 2F7/S5A+ 细胞。然后计算每升血中上述细胞含量。结果 (1)外周血单核细胞的表型为CD45+ CK- 2F7/S5A- ,而小细胞和非小细胞肺癌细胞系均为CD45- CK+ 2F7/S5A+ 。因此,应用此方法能从106 白细胞中检测到1个肺癌细胞,敏感性达到每毫升血中检测到5 个肺癌细胞;(2)15 例正常人及7 例肺部良性疾患外周血中CD45- CK+ 2F7/S5A+ 细胞均为阴性,而40例肺癌患者外周血14 例发现阳性细胞,阳性率达35 % ,阳性细胞含量平均为1×105 /L。结论 本方法具有较好的敏感性和特异性。

大剂量化疗和体外扩增的骨髓细胞移植对小鼠Lewis肺癌的实验性治疗研究

目的本文比较常规剂量和大剂量ＶＩＰ方案化疗对小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌的疗效，同时分析应用体外扩增的骨髓细胞进行移植治疗的可行性。方法骨髓细胞采用微血管内皮细胞共培养方法进行体外培养扩增。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠皮下接种１×１０６Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞，接种后第３天和第１４天分别进行常规剂量和大剂量ＶＩＰ方案化疗。常规剂量ＶＩＰ方案（ＶＩＰＣＤ）为顺铂（４ｍｇ／ｋｇ，腹腔注射，第１天），异环磷酰胺（２００ｍｇ／ｋｇ，腹腔注射，第２天）和依托帕甙（２ｍｇ／ｋｇ，腹腔注射，第１～２天）。大剂量ＶＩＰ方案（ＶＩＰＨＤ）是将上述药物的剂量分别提高２．５倍，用法同上。ＶＩＰＨＤ化疗后２４ｈ经尾静脉移植３×１０６体外扩增的骨髓细胞。采用定期测量肿瘤体积和随访小鼠生存时间进行疗效评定。结果对早期肿瘤（接种后３天，平均肿瘤直径为０．５ｃｍ），ＶＩＰＣＤ化疗明显抑制肿瘤生长；但对接种后２周的巨大肿瘤（平均肿瘤直径１．５ｃｍ），应用该方案间隔２周连续治疗３个疗程仍不能有效控制肿瘤生长。上述实验中ＶＩＰＣＤ治疗组的中位生存期与对照组相比无统计学显著差异（Ｐ＞０．０５）。与此相反，单次ＶＩＰＨＤ化疗和骨髓移植显著控制了早期肿瘤生长，使治愈率达到９?

诱导体外扩增的小鼠骨髓CD34^+造血细胞分化为树突状细胞

诱导体外培养扩增后的小鼠骨髓ＣＤ３４＋造血细胞分化为树突状细胞（ＤＣ）。方法Ｃ５７ＢＬ／６ｊ小鼠骨髓ＣＤ３４＋细胞采用血管内皮细胞共培养方法进行体外扩增，扩增后的ＣＤ３４＋细胞经磁性细胞分选技术纯化，并用ＧＭ┐ＣＳＦ等细胞因子诱导其向ＤＣ分化。结果小鼠骨髓ＣＤ３４＋造血细胞不论是否经过体外培养均可被诱导分化为ＤＣ，后者具有典型的树突状形态特征，表达高水平的ＭＨＣⅠ、Ⅱ类抗原和ＣＤ８６共刺激分子，在混合白细胞反应（ＭＬＲ）中能有效地刺激静息期Ｔ淋巴细胞增殖。结论小鼠骨髓ＣＤ３４＋细胞经体外培养扩增后仍然具有向ＤＣ分化的能力，通过骨髓细胞体外培养扩增可以显著提高ＤＣ产量。

树突状细胞疫苗治疗肺癌血源性转移的实验研究

目的 探索应用树突状细胞肿瘤疫苗治疗肺癌血源性转移的可能性。方法 将Lewis肺癌细胞经尾静脉注射给C57BL/6J纯系小鼠建立肺癌血源性转移模型,应用树突状细胞负载合成的抗原多肽MUT-1,作为肿瘤疫苗进行免疫治疗。存活的小鼠再用10 倍数量的癌细胞皮下攻击,观察其免疫保护效应。这些小鼠的脾脏T淋巴细胞经纯化后进行体外抗原致敏,然后测定其特异性细胞毒效应。结果 尾静脉注射Lew is肺癌细胞可引起多脏器肿瘤播散,造成所有荷瘤小鼠死亡。但在注射Lewis肺癌细胞后24 h,用树突状细胞疫苗进行免疫治疗,可以完全控制转移病灶的形成及因肿瘤转移引起的死亡,这些小鼠对10 倍数量的Lew is 肺癌细胞再次攻击,具有显著的免疫保护作用。其脾脏T淋巴细胞对Lewis肺癌细胞具有特异性细胞毒效应。结论 树突状细胞疫苗治疗能够有效地清除血源性播散的肺癌细胞。

体外扩增的小鼠骨髓CD34^+和c-kit^+细胞具有长期造血功能

目的应用小鼠骨髓微血管内皮细胞能够在体外大量扩增骨髓造血细胞。本文旨在进一步研究（１）内皮细胞分泌的造血细胞因子；（２）优化培养条件，提高骨髓细胞的扩增指数；（３）扩增细胞的长期造血重建功能。方法采用ＲＴ┐ＰＣＲ和生物活性测定技术分析内皮细胞表达的造血细胞因子；小鼠骨髓细胞经与内皮细胞共培养方法进行扩增，扩增的骨髓细胞移植给大剂量化疗后的异基因小鼠，然后检测外周血中供体细胞的比例。结果（１）内皮细胞能持续地、或经肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）刺激后表达干细胞因子（ＳＣＦ）、血小板生成因子（ＴＰＯ）和白介素┐６（ＩＬ┐６）；（２）将Ｃ５７小鼠骨髓细胞置于ＴＮＦα刺激后的内皮细胞层上４小时，粘附的骨髓细胞在０．２５μｇ／ｍｌ重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ┐ＣＳＦ）存在下培养１周，细胞数量增加了６０倍，其中ＣＤ３４＋细胞和ｃ┐ｋｉｔ＋细胞比例分别为５８．５％和６３．９％；（３）将扩增的Ｃ５７小鼠骨髓细胞移植给大剂量ＶＩＰ方案化疗（顺铂，１０ｍｇ／ｋｇ，腹腔注射，第一天；异环磷酰胺，５００ｍｇ／ｋｇ，腹腔注射，第２天；依托帕甙，５ｍｇ／ｋｇ，腹腔注射，第１～２天）后的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，８周时外周血供体细胞比例达３５％。?

用微血管内皮细胞体外扩增的骨髓造血干细胞重建大剂量化疗后的小鼠造血功能

目的探索造血干细胞体外培养扩增的新方法。方法采用磁性细胞分离技术纯化小鼠骨髓血管内皮细胞，将其与骨髓造血细胞一起培养。培养的骨髓细胞移植给大剂量化疗后的小鼠，观察其造血重建功能。结果纯化的血管内皮细胞具有鹅卵石样细胞形态，表达多种内皮细胞相关抗原如ＣＤ３１，ＣＤ３４，ＩＣＡＭ１，ＶＣＡＭ１和凝集素ＢＳ１结合位点。将内皮细胞与骨髓造血细胞共同培养后，骨髓细胞数明显增加，其中６０％为原始的造血细胞，后者移植后能有效重建血功能。结论骨髓微血管内皮细胞能促进造血干细胞体外扩增，并有效阻止其分化。扩增的造血干细胞具有造血重建功能。

肿瘤转移与肿瘤干细胞研究

转移是恶性肿瘤的基本属性之一,也是临床治疗中一个棘手的问题,因而探索肿瘤转移的细胞学和分子生物学基础并寻找新颖的诊治靶标,是当前普遍关注的一个研究热点。肿瘤干细胞是恶性肿瘤的起始细胞,但最近的研究揭示,此类癌细胞也与肿瘤转移密切相关。本文简要综述了这一领域的最新研究进展。

上皮生长因子受体外显子21基因突变L858R的实时定量PCR检测

目的应用实时定量PCR技术建立上皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)外显子21基因突变L858R的检测新方法。方法根据Taqman-MGB原理设计野生型外显子21和L858R特异性探针,经过优化制备成试剂盒检测171例肺癌组织中的L858R基因突变,并将结果与基因测序进行对比分析。结果171例肺癌组织经基因测序共检出L858R突变15例,突变率为8.8%。突变多见于女性、肺腺癌及腺鳞癌。定量PCR检测显示,15例突变型组织的R值平均为0.840±0.223,而156例野生型组织的R值平均为1.552±0.278,两组间差异具有统计学显著意义(P<0.001)。此外,以突变型为主的肺癌组织其R值(0.613±0.137)显著低于野生型占优势组织(0.992±0.103),两组间差异极为显著(P<0.001)。实验证明,定量PCR检测方法对L858R基因突变具有高度特异性,其最低检测限度为突变型DNA占野生型DNA含量的12.5%。结论本方法检测EGFR基因L858R突变具有敏感性高、特异性好、简便快速等优点,应用本方法不仅可以对野生型EGFR外显子21或突变型L858R进行诊断,而且还可以根据R值判断样本中突变型基因的比例。

造血干细胞体外扩增在肺癌治疗中的应用前景

造血干细胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｓ，ＨＳＣ）的体外扩增是近十年来颇受关注的一项新技术。由于通过培养扩增可以显著增加ＨＳＣ数量，其在恶性肿瘤治疗上具有重要应用价值：（１）配合大剂量化疗（ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅｃｈｅｍｏｔｈｅｒｐａｙ）可...

肺癌血浆VEGF、血循环癌细胞及树突状细胞相互关系的研究

目的 分析非小细胞肺癌 (NSCLC)患者VEGF血浆含量与癌细胞血道转移及树突状细胞 (DC)成熟的关系。方法 外周血获自正常人、肺部良性疾患以及NSCLC患者。血循环中的癌细胞和DC按已建立的流式细胞仪定量分析技术进行检测。血浆VEGF含量采用ELISA方法测定。结果 12例正常人及 13例肺部良性疾患的血浆VEGF平均含量分别为 15 .7和 13.2 pg /ml,而 12 3例NSCLC患者的血浆VEGF平均含量为 140 .8pg /ml,显著高于正常人及肺部良性疾患者 (P <0 .0 0 1)。正常人及肺部良性疾患者外周血中癌细胞检测均为阴性 ,而 6 9例NSCLC患者血样中 32例阳性 ,阳性率为 46 .4% ,阳性患者的癌细胞平均含量为 0 .471× 10 6/L。正常人及肺部良性疾患者外周血中DC含量分别为 2 9.0和 2 2 .0× 10 6/L ,而 5 4例NSCLC患者的DC含量为 15 .9× 10 6/L ,显著低于正常人及肺部良性疾患者 (P <0 .0 5 )。若以VEGF≤ 5 6pg/m1作为正常值 ,则VEGF增高的NSCLC患者外周血中癌细胞阳性率及其含量明显增高而DC含量显著降低 ,其中以III、IV期患者最为突出。结论 NSCLC患者血浆VEGF增高具有促使癌细胞血道播散和抑制DC成熟的效应。

造血干细胞移植和支持的实验室质量控制

大多数细胞毒性化疗药物对癌细胞的杀灭作用具有剂量依赖性。单位时间内给予超过常规化疗剂量数倍的化疗药物，可以显著提高疗效。近几十年来大剂量化疗（ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）已被广泛用于治疗白血病等血液系恶性肿瘤，获得了满意效果。最近，一...

肺癌干细胞的球体形成与致瘤性分析

目的：从人肺腺癌细胞株SPC—A1中诱导球体形成，对其中的肺癌干细胞进行鉴定并评估其致瘤能力。方法：无血清条件下培养肺癌细胞，采用表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、重组人胰岛素样生长因子-1（insulin—like growth factor-1，IGF-1）和重组人成纤维细胞生长因子-10（fibroblast growth factor—10，FGF-10）等细胞生长因子诱导球体形成，球体细胞采用RT—PCR及免疫荧光技术检测干细胞相关标志的表达，并通过NOD—SCID小鼠移植评估其致瘤性。结果：SPC—A1肺腺癌细胞经培养5—10d后，即可形成悬浮生长的细胞球体（肺球体）。RT—PCR检测显示肺球体细胞表达肺癌干细胞表面标志CD24和CD221．细支气管肺泡干细胞标志Clara细胞分泌蛋白和肺泡活性蛋白C，胚胎干细胞主干基因OCT4、Nanog和Bmi-1，以及肺干细咆主干基因甲状腺转录因子-1。采用免疫荧光检测其中3个标志的蛋白表达，证实80％以上的肺球体细胞呈Clara细胞分泌蛋白、肺泡活性蛋白C和OCT4染色阳性。肺球体细胞具有高致瘤性，在NOD—SCID小鼠中移植5103个细胞即可形成肿瘤。结论：肺球体细胞中肺癌干细胞高度富集并具有致瘤性。

上海汉族优秀耐力运动员ACE基因I/D多态性与最大有氧能力(O_2max)的关联研究

采用PCR和breath by breath方法，对上海汉族55名优秀游泳运动员、60名优秀赛艇运动员和85名汉族普通人的ACE基因I／D多态性和VO2max进行检测。结果显示：1）上海汉族优秀游泳和赛艇运动员ACE基因的基因型和等位基因频率与上海和成都地区汉族普通人组无明显差异（P〉0．05）；与Caucasian人群相比，均存在非常显著性差异（P〈0．0001），表现出明显的民族和地区的差异性；游泳和赛艇项目健将和一级运动员间的基因型和等位基因频率分布，存在明显差异（P〈0．05）；游泳运动员水平越高，Ⅱ型所占比例就越高，赛艇运动员中水平越高，ID型的比例越大；2）不同基因型的游泳运动员的VO2max、VO2max／kg、VCO2max、VEmax、O2-plusemax、Wmax和Tmax等指标，均表现为Ⅱ型〉DD型〉ID型，Ⅱ型明显优于ID型（P〈0．05～0．01），而赛艇运动员则表现为ID型〉Ⅱ型〉DD型，ID明显优于DD型（P〈0．05～0．01）。结果提示，游泳项目中具有Ⅱ基因型或Ⅰ等位基因的运动员，赛艇项目中具有ID基因型或Ⅰ等位基因的运动员，可能属于运动训练敏感的高反应群体，经过多年系统科学的训练，具有成为优秀运动员的可能。ACE基因I／D多态性可作为运动训练和选材中高敏感的、非常重要的遗传标记之一。

人骨髓间充质干细胞的体外培养及诱导分化

目的建立一株能在体外长期培养并具有多向分化潜能的人骨髓间充质干细胞(HBMSC).方法利用差异贴壁法从人肋骨中分离纯化HBMSC,在体外通过地塞米松、胰岛素诱导分化为脂肪细胞,用VitC、β-磷酸甘油、地塞米松诱导下可分化成骨细胞,裸鼠体内分化为软骨样细胞及成骨样组织,采用流式细胞仪检测细胞表面CD31、CD34、CD45、CD9、CD90、CD105和CD106.以2.5×107细胞接种于裸鼠皮下进行致瘤实验,用DY-NALREU-SSO反向杂交法检测HLA.结果细胞已连续培养超过30代仍能稳定生长,细胞表面特性为CD105、CD106阳性,而CD31、CD34、CD45、CD9、CD90为阴性.在体外能诱导成脂肪细胞、成骨细胞.无致瘤性,在裸鼠体内能形成软骨细胞及骨样组织.结论培养了一株能在体外长期培养及具有多向分化潜能的人骨髓间充质干细胞.

肺癌患者血浆中血管内皮生长因子与碱性纤维母细胞生长因子表达

目的 研究血管内皮生长因子 (VEGF)与碱性纤维母细胞生长因子 (bFGF)在肺癌患者血浆中表达水平。方法 采用定量免疫酶标 (ELISA)方法 ,检测 92例肺癌患者及肺部良性疾病血浆中VEGF与bFGF的含量。结果 84例肺癌与 7例肺部良性疾病血浆中VEGF含量分别为 2 0 1.5± 183.0pg/ml,10 2 .5± 6 2 .5pg/ml,两者差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;其中 4 4例腺癌和 7例小细胞癌的VEGF含量分别为 2 0 2 .3± 177.0pg/ml、381.4± 314 .3pg/ml,与其肺部良性疾病比较 ,差异均有显著性 (分别为P <0 .0 5、P <0 .0 0 1)。在 5 6例肺癌与 4例肺部良性疾病血浆中bFGF含量分别为 4 5 .4± 2 3.9pg/ml,5 0 .4± 2 7.2pg/ml,两者差异无显著性。结论 在肺癌患者血浆中VEGF的含量明显高于肺部良性疾病的含量 ,其中腺癌和小细胞肺癌差异有显著性。

血清循环DNA的EGFR基因突变与肺癌选择性靶向治疗研究

目的:通过血清循环DNA的基因突变检测,筛选EGFR突变型肺癌患者并评估靶向性药物吉非替尼对其的临床疗效。方法:从肺癌患者血清中提取DNA,采用PCR扩增和基因测序检测EGFR突变。结果:116例肺癌血样中检出EGFR突变46例,突变率为39.7%,其中外显子19和21突变分别占65.2%(30/46例)和34.8%(16/46例),EGFR基因突变多见于女性患者和肺腺癌(包括腺鳞癌)患者。对20例肺癌的进一步分析证明,血清EGFR基因突变类型与患者自身肿瘤的突变类型相同。另外通过血清循环DNA基因检测法筛选了19例化疗失败的突变型晚期肺癌进行吉非替尼靶向治疗,客观有效率为52.6%,病情控制率为89.5%,中位无进展生存时间为8个月,中位生存时间为12个月,2年生存率达到33.3%。结论:证实血清循环DNA与肿瘤组织DNA的EGFR基因突变一致;以血清循环EGFR突变检测结果为依据选择分子靶向性药物吉非替尼治疗,对晚期肺癌患者疗效明显。

上海地区汉族优秀游泳运动员ACE基因I/D多态性研究

目的:探讨上海地区汉族不同水平优秀游泳运动员ACE(血管紧张素转化酶)基因I/D多态性的分布特点。方法:采用PCR方法,对上海地区85名汉族优秀游泳运动员和90名汉族普通人的ACE基因I/D多态性进行检测。结果显示,上海地区汉族优秀游泳运动员的ACE基因的基因型和等位基因频率与上海和成都地区汉族普通人无明显差异(P>0.05);上海地区汉族游泳运动员和普通人以及成都地区汉族普通人的基因型和等位基因频率均与高加索人群存在高度显著性差异(P<0.0001),表现出明显的种族差异性。7名上海地区汉族国际健将ACE基因均为II型,运动水平越高的组别,II基因型和I等位基因频率越高,提示具有II基因型或I等位基因频率高的运动员经过多年运动训练,具有成为优秀运动员的可能,特别是II基因型的运动员可能性更大。

非小细胞肺癌外周血树突状细胞含量与血管内皮生长因子浓度的关系

目的 检测非小细胞肺癌 (NSCLC)外周血树突状细胞 (DC)含量和血管内皮生长因子 (VEGF)水平 ,探讨二者间的相互关系。方法 采用流式细胞技术对 5 5例NSCLC、13例肺部良性病变及 12例正常人外周血DC含量进行检测 ,并用ELISA法检测血浆VEGF浓度。结果 肺部良性病变者的外周血DC含量和VEGF浓度与正常人相比无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,但NSCLC患者外周血DC含量显著降低 ,而血浆VEGF浓度显著增高 (P <0 .0 5～ 0 .0 1)。NSCLC外周血DC含量及VEGF浓度与性别、年龄、病理类型及分化程度无明显关系 ,但与临床分期和淋巴结转移有密切关系 (P <0 .0 5 )。外周血DC含量与VEGF浓度呈负相关。结论 NSCLC外周血DC含量降低和VEGF浓度增高与肺癌恶性程度有密切关系。NSCLC过表达VEGF可能是导致DC分化受阻的主要原因之一。