人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体的构建及测序

目的利用RNA干扰技术,以人CCL20基因为靶基因,设计CCL20基因特异性的小干扰RNA(siRNA),构建其短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定。方法设计并合成人CCL20基因特异性的DNA寡核苷酸,连接到经SpeⅠ和SalⅠ双酶切线性化的pHSER dsRNA GFP SIN质粒上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性菌落、扩增后提取质粒,进行DNA测序鉴定。结果将合成的两对人CCL20基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后,分别克隆到线性化的pHSER dsRNA GFP SIN载体质粒上。在氨苄青霉素培养基条件下,筛选出相应的阳性菌落,经DNA测序鉴定确实为所需序列。结论构建成功了2对人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体,可进一步用于干扰CCL20基因的mRNA转录,从而为制备CCL20基因表达抑制型的人角朊干细胞奠定基础。

微电流刺激表皮角朊细胞体外增殖的培养模型

目的:建立微电流作用于角朊细胞的体外模型,观察微电流对角朊细胞增殖等细胞行为的影响。方法:实验于2003-08/2004-08在第三军医大学烧伤研究所实验室完成。所用细胞来自西南医院泌尿外科3例行包皮环切术患者的手术切除包皮标本,患者均知情同意,每个标本均独立进行实验,分为对照组和电刺激组。模型建立:在细胞培养皿中部组建3.0cm×1.0cm×1.0cm大小的培养小室,底部分别用镍铬合金丝或纯铂丝作为电极,同时自行制作输出电流范围为4～1800μA的微电流发生器。电刺激后观察两种电极周围是否发生影响细胞生长的副反应,选择未发生副反应的电极应用于模型中。把手术切除的包皮皮片用中性蛋白酶和胰蛋白酶消化以获取角朊细胞,精制无血清培养基培养。电刺激组给予一定强度频率和时间脉冲交流电刺激后,用碘化丙啶染色,选流式细胞术分析两组角朊细胞周期变化。结果:①镍铬电极的培养模型,制作比较复杂,电极周围易发生通电引起的副反应,电刺激1d后,电极附近生出淡绿色电解反应产物;纯铂电极的培养模型,制作过程相对简单,持续7d电刺激后,电极周围无化学反应,该模型选用了纯铂电极。②自制的微电流发生器输出功率稳定,电流强度可在4.0～1800μΑ之间调节。③角朊细胞DNA合成前期对照组比电刺激组所占百分率明显降低[(52.76±3.57)%,(46.63±0.38)%,t=2.953,P<0.05];合成期、合成后期和分裂期电刺激组所占百分率稍高于对照组[(29.54±16.27)%,(27.02±18.27)%;(23.84±16.48)%,(20.21±17.90)%],说明该组角朊细胞DNA合成活跃,细胞分裂数目增多。④在纯铂电极的培养模型中,电刺激4d后,角朊细胞呈多角形,核分裂相多见,细胞生长旺盛,在小室中的融合现象更加明显。结论:微电流刺激下,角朊细胞DNA的合成活跃,细胞分裂数目增多。自制纯铂电极培养模型输出功率稳定,电流强度可控,能满足细胞长期电刺激培养的需要,为进一步研究电流对细胞增殖的影响提供了技术平台。

汉黄芩素对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡、Survivin及Caspase-3表达的影响

目的探讨汉黄芩素在人胶质瘤患者中对U251细胞的增殖与凋亡及对存活素(Survivin)及半胱天冬酶-3(Caspase-3)表达的影响。方法不同浓度汉黄芩素作用于人胶质瘤96株U251细胞,并与使用替莫唑胺(TMZ)的阳性对照组(48株)及未给予任何药物的空白对照组(48株)对比细胞增殖抑制率、细胞凋亡率及Survivin和Caspase-3蛋白的表达强度。结果各浓度汉黄芩素对细胞增殖抑制率均显著高于空白对照组,且随药物浓度及作用时间的增加呈现出显著增高趋势(P<0.05),汉黄芩素组细胞凋亡率显著高于TMZ组(P<0.01),TMZ组显著高于空白对照组(P<0.01),在汉黄芩素组内,细胞凋亡率随着药物浓度增加显著增加(P<0.05);汉黄芩素组Survivin表达强度显著低于TMZ及空白对照组(P<0.01);两药物组Caspase-3表达强度显著高于空白对照组(P<0.01)。结论汉黄芩素可通过调节Survivin、Caspase-3蛋白的表达对胶质瘤U251细胞起到诱导凋亡的作用。

汉黄芩素对胶质瘤U251细胞Surviv inmRNA及Caspase-3 mRNA表达的影响研究

目的探讨汉黄芩素对胶质瘤U251细胞SurvivinmRNA及Caspase-3 mRNA表达的影响。方法 192株人胶质瘤U251细胞株分别用汉黄芩素(96株)、替莫唑胺(TMZ)(48株)处理,留取48株作为空白对照组,半定量RT-PCR法检测Surviv inmRNA与Caspase-3 mRNA表达强度,并在3组之间进行对比分析。结果空白对照组Surviv inmRNA表达强度为(0.773±0.176)μM,显著高于汉黄芩素组的(0.382±0.087)μM及TMZ组的(0.408±0.092)μM(P<0.05);Caspase-3 mRNA表达强度为(0.097±0.043)μM,显著低于汉黄芩素组的(0.454±0.213)μM及TMZ组的(0.432±0.187)μM(P<0.05),汉黄芩组与TMZ组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论汉黄芩素可通过下调Surviv inmRNA的表达并上调Caspase-3 mRNA的表达起到有效诱导人胶质瘤U251细胞凋亡的作用。

神经氨酸酶预处理对大鼠骨髓细胞分布及造血集落形成的影响

目的通过观察不同浓度的神经氨酸酶(neuraminidase,Neu)预处理供体骨髓细胞(donor bone marrow cells,dBMCs),经外周静脉注射后在受体内各主要组织器官的分布及对肝脏造血集落形成的影响,筛选出使dBMCs靶向性分布于肝脏的Neu最适浓度。方法以雄性SD大鼠为供体,Wistar雌性大鼠为受体。在dBMCs分布研究中,常规从雄性SD大鼠的股、胫骨制备dBMCs并用Neu处理。按Neu处理dBMCs的浓度将26只受体Wistar雌性大鼠分为4组,尾静脉注射99Tcm标记的dBMCs,5h后测定各组织器官的放射性活度。在造血集落形成研究中,受体Wistar雌性大鼠12只随机分为2组,尾静脉注射处理及未处理的dBMCs15d后,取受体各主要器官,行病理组织学检测,光镜下观察造血集落形成情况。结果在同一受体内,肝脏的dBMCs百分含量明显高于其他所测器官;以1·0U/ml浓度的Neu预处理时,受体肝脏内dBMCs百分含量高于对照组,差异显著(t=2·653,P=0·024),而肾脏内dBMCs百分含量低于对照组,差异显著(t=3·067,P=0·012),脾脏内dBMCs百分含量明显低于对照组,差异非常显著(t=3·265,P=0·009)。尾静脉注射15d后受体肝内可见造血集落形成,造血集落数量和形态上实验组与对照组无差别。结论在浓度为1·0U/ml时,神经氨酸酶预处理可增强骨髓细胞与肝脏的亲和性,使经外周静脉输注的骨髓细胞靶向性分布于受体肝脏内,但对肝脏内造血集落的形成无影响。

静脉注射表皮角朊细胞在烫伤大鼠各主要器官的分布

目的:烧伤创面的修复在很大程度上取决于表皮角朊细胞迁移、增殖和在相应器官的分化,通过静脉注射表皮角朊细胞,了解其在烫伤大鼠主要器官的分布情况。方法:实验于2003-03/2004-06在第三军医大学西南医院全军烧伤研究所完成。取38只Wistar新生鼠的表皮,采用Dispase和胰蛋白酶消化法,制备出角朊细胞悬液,然后用99Tcm标记。12只Wistar大鼠麻醉后沸水烫伤背部10s,制作20%Ⅲ度烫伤模型。实验分为对照组(假伤)、烫伤0d、烫伤3d和烫伤7d组,分别在假伤后1h内、烫伤后1h内、3d和7d经尾静脉注射99Tcm标记的角朊细胞悬液。注射后4h,单光子发射型计算机断层扫描仪检测大鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾、胸腺、皮肤或/和创面)的放射性活度,计算出各器官放射性计数角朊细胞分布的百分率。结果:4组12只大鼠进入结果分析。①对照组、烫伤0d组、烫伤3d组和烫伤7d组大鼠单光子发射型计算机断层扫描仪检测到的放射性活度主要分布在肺脏(66.8%～77.6%),肝脏10.8%～21.5%。②烫伤7d组大鼠肾脏的放射性活度百分率与对照组比较明显增加(12.2%,2.6%),皮肤或/和创面的放射性活度百分率在伤后仅略有增加(从0.64%到5.11%)。结论:经静脉注射的表皮角朊细胞主要随血循环向正常和烧伤大鼠的肺脏和肝脏迁移;烫伤后7d时角朊细胞向肾脏迁移显著增多,而向肺脏迁移有所减少。烫伤后迁移到皮肤或/和创面的角朊细胞仅略有所增多。

输入性疟疾合并血小板减少1例

收治1例在外院诊断为上呼吸道感染的患者，因后期血小板减少而重新确诊为输入性疟疾，报告如下。

单核细胞增生性李斯特菌致颅内感染1例

患者男,58岁,因突然出现头痛、意识障碍伴发热1d于2016年10月29日入院。患者入院前1d突然出现意识模糊、高热(最高39.6°C),送当地医院诊断为"脑炎"。清醒后转入我院,自觉剧烈头痛、恶心。入院时体格检查:体温37.4℃:,脉搏88次/min,呼吸16次/min,血压127/80mmHg;意识清楚;双瞳孔等大等圆,直径2.5mm,对光反射灵敏;颈部硬,有抵抗感;心、肺、腹部无异常;四肢肌张力、肌力正常,右下肢Babinski征(+),未引出其他病理征。血液检查:红细胞4.31X1012/L,白细胞22.5X109/L(升高),血小板156X109/L,血红蛋白138g/L,中性粒细胞计数20.25X109/L,中性粒细胞比例0.899,嗜酸粒细胞计数0.07X109个/L,嗜酸粒细胞比例0.03,嗜碱粒细胞计数0,嗜碱粒细胞比例0.

氢氟酸烧伤36例

氢氟酸具有强烈腐蚀性，是制造无机和有机氟化物的原料，广泛用于医药、橡胶、电子、钢铁、制冷等工业。生产和使用过程中，常因各种意外事故导致氢氟酸烧伤。笔者所在科从1998～2008年共收治36例氢氟酸烧伤患者。男30例，女6例；年龄23～71岁。化工厂工人32例，拾荒者4例（头面部5例，手25例，前臂9例，上臂5例，躯干6例，下肢3例）。

不同厚度异体皮制备的微粒皮混合自体微粒皮移植对创面愈合的影响

目的 观察不同厚度异体皮制备的微粒皮混合自体微粒皮移植于大鼠背部全层皮肤缺损后对创面愈合的影响。 方法 制作大鼠全层皮肤缺损创面模型。以移植面积扩张比为 5∶1的自体微粒皮为对照组 ( 10只 ) ,两种不同厚度异体皮制备的微粒皮与同样扩张比的自体微粒皮混合移植为实验组 ,其中实验 1组异体微粒皮厚度为 0 .3mm(10只 ) ,实验 2组 0 .6mm(6只 )。比较移植后 2、3、4周 3组大鼠创面愈合率、收缩率及组织学差异。 结果 创面愈合率 :移植后 2周实验 1组大鼠( 94 .5 8± 3.99) %和实验 2组 ( 95 .2 8± 1.93) %均高于对照组 ( 88.2 8± 6 .85 ) % (P <0.0 5 ),移植后 3周实验 2组 ( 94 .5 5± 3.4 7) %高于实验 1组 ( 89.5 1± 4 70 ) %及对照组 ( 88.5 1± 5 .5 9) % (P <0.0 5),移植后 4周 3组比较 ,差异无显著性意义 (P >0 0 5 )。创面收缩率 :实验 1组大鼠与对照组比较 ,差异无显著性意义 (P >0.0 5),实验 2组各时相点均低于实验 1组及对照组 (P <0.0 5)。组织学检查 :移植后 2周实验组大鼠有明显的淋巴细胞灶性浸润 ,移植后 4周 3组之间比较 ,差异无显著性意义 ( P>0.0 5 )。结论 适量的异体微粒皮混合自体微粒皮移植 ,可以促进创面愈合 ;混合移植等量异体微粒皮时增加其真皮厚度 。

自异体微粒皮混合移植的优化比例研究

目的观察不同比例自异体微粒皮混合移植后创面愈合的效果。方法以雄性 Wistar大鼠为供体,在雌性SD大鼠背部建立全层皮肤缺损创面模型。将SD大鼠随机分为4组,每组 10只:(1)异体皮组,移植面积扩张比为10:3的异体微粒皮。(2)自体皮组,移植面积扩张比为10:1 的自体微粒皮。(3)混合1组,自异体微粒皮移植面积扩张比各为10:1。(4)混合2组,自异体微粒皮移植面积扩张比分别为10:1和10:3。于移植术后2、3、4周对各组大鼠创面进行外观和组织学观察,数码相机照相后运用图像分析软件测定创面愈合率和创面收缩率,并进行各组间的比较。结果 (1)异体皮组大鼠创面随着排斥反应发生,除创缘有新生表皮向内爬行外均为肉芽创面;自体皮组阅微粒皮数量偏少,术后2周仍有部分为肉芽创面;两个混合移植组术后2周创面基本上皮化。(2)移植后各组创面真皮内有不同程度的血管扩张和单个核细胞浸润,在异体皮组和混合2组中更加明显, 自体皮组及混合1、2组大鼠创面的表皮层明显增厚。(3)异体皮组移植后2-4周,随着排斥反应的发生,其创面愈合率明显下降。移植后3周,自体皮组创面愈合率为(55±26)％,明显低于混合1、2 组的(88±6)％和(76±10)％(P<0．05或0．01)。(4)移植后3周,混合2组创面收缩率为(69± 7)％,高于异体皮组[(58±11)％],其余各组之间比较差异无统计学意义(P>0．05)。结论适当比例的自异体微粒皮混合移植,可以促进创面愈合;当两者移植面积扩张比均为10:1时,具有较好的促创面愈合效果。

神经氨酸酶预处理供体骨髓细胞延长大鼠异体移植物成活时间的观察

目的筛选神经氨酸酶(Neu)预处理供体骨髓细胞(dBMCs)的最佳浓度,使经大鼠尾静脉注射该浓度Neu后的dBMCs偏向性分布于受体肝脏,并观察Neu预处理dBMCs(Neu-dBMCs)联合环孢素A(CsA)短期应用对异体皮片成活时间的影响。方法供体为雄性SD大鼠49只,受体为雌性Wistar大鼠49只。常规制备dBMCs并留取供体皮片备用。Neu预处理浓度筛选实验：按Neu终浓度将26只受体大鼠随机分为0、0．5、1．0、2．0 U/ml 4组(各组分别为6、8、6、6只),用上述4种浓度Neu预处理dBMCs,以^(99m)Tc-SnCl_2法标记,再经受体尾静脉注入,5h后取受体各主要器官,测定其放射性活度,计算出各器官的放射性活度占全部所测器官总放射性活度的百分比,筛选出使dBMCs偏向性分布于受体肝脏的最佳Neu预处理浓度。异体皮片移植实验：将余下23只受体大鼠随机分为对照组、dBMCs组和Neu-dBMCs组,每组均行异体皮片移植,其中后两组在手术当天经尾静脉分别输注dBMCs和Neu-dBMCs(Neu为筛选出的最佳浓度),并分别于术后第2、5天腹腔注射CsA (10 mg/kg),观察各组异体皮片的成活情况。结果在Neu预处理浓度为1．0U/ml时,受体肝脏内dBMCs呈偏向性分布,其百分比为(75．3±9．8)%,明显高于其他浓度组,与0 U/ml组[(58．9±4．2)%]比较差异有统计学意义(P＜0．01)。1．0 U/ml为Neu的最佳浓度。Neu-dBMCs组的同种异体皮片成活时间较dBMCs组明显延长,两组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。这两组异体皮片成活时间均较对照组明显延长(P＜0．01)。结论适当浓度的Neu预处理可增强dBMCs与肝脏的亲和性,使经外周静脉输注的dBMCs偏向性分布于受体肝脏内。Neu-dBMCs短期联合应用CsA可明显延长移植的供体皮片成活时间。

5％自体微粒皮混合不同比例异体微粒皮移植促进创面愈合效果的研究

目的 5％自体微粒皮混合不同量异体微粒皮移植于大鼠背部全层皮肤缺损创面,观察创面愈合和收缩情况,优化异体微粒皮加入量以达到较好的促创面愈合效果。方法实验以雌性SD大鼠为受体,在其背部建立全层皮肤缺损创面模型。供体为雄性Wistar大鼠。实验分3组, 每组10只,其中对照组仅植入移植面积扩张比为20:1的自体微粒皮;实验1组和实验2组自体微粒皮的移植面积扩张比均为20:1,加入的异体微粒皮的移植面积扩张比分别为20:3和20:6。术后 3、4周分别测定创面愈合率和收缩率,比较各组之间的区别。结果术后3、4周实验1、2组大鼠创面愈合率均明显高于对照组(P<0．01);实验组之间的差异也均有统计学意义(P<0．05),其中实验2组创面愈合情况要优于实验1组。就创面收缩而言,各组之间差异无统计学意义(P> 0．05)。结论适量的异体微粒皮混合自体微粒皮移植可促进创面愈合;在移植面积扩张比为20:1 的自体微粒皮中,混合移植面积扩张比为20:6的异体微粒皮较混合20:3的异体微粒皮具有更佳的促创面愈合效果。

CCL20基因敲低型组织工程皮肤种子细胞的克隆筛选及其干扰效果

目的采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染人永生化角质形成细胞系（HaCaT），筛选出稳定干扰CCL20基因表达的细胞克隆并检测其干扰效果。方法用CaCl2法将已构建好的3种pHSER—CCL20-shRNA—GFP载体（pHCG-1和pHCG-2为CCL20基因特异性，pHCG-3为CCL20基因错配）转染293FT包装出慢病毒颗粒，流式细胞术测定其病毒滴度。用G418压力筛选慢病毒感染的HaCaT，荧光定量RT—PCR和ELISA法分别检测CCL20基因mRNA和蛋白的表达水平，以判断其特异性干扰效果。结果三种慢病毒载体所包装出的慢病毒滴度分别为7．08×10^5转导单位（TU）／ml、1．88×10^5TU／ml和2．08×10^5TU／ml；感染后的HaCaT经过G418筛选5～8周，获得4株CCL20基因特异性的细胞克隆（HaCaT-1、HaCaT-2、HaCaT-3和HaCaT-4）及2株CCL20基因错配对照的细胞克隆（HaCaT-5和HaCaT-6）。经荧光定量PCR和ELISA法检测显示，4株CCL20基因特异性细胞克隆均具有稳定干扰效果，不仅能显著地下调CCL20基因的mRNA表达（其抑制率分别为81．0％、89．0％、81．3％、77．2％），而且明显地减少CCL20蛋白分泌（其抑制率分别为70．0％、86．1％、88．1％、90．7％）。结论采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染HaCaT可以筛选出具有长期稳定表达RNA干扰效应的CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞克隆，将可能为低免疫排斥反应异基因组织工程皮肤的构建提供种子细胞。

大鼠微粒皮移植创面中角蛋白19及整合素β1的异位表达

目的了解大鼠微粒皮移植后创面角蛋白19、整合素β1表达特征的变化,初步探讨微粒皮移植创面的愈合机制。方法取20只大鼠制成全层皮肤缺损创面模型,分为自体皮组:创面移植占缺损皮肤表皮质量10%的自体微粒皮;混合皮组:创面混合移植自、异体微粒皮,其用量分别为缺损皮肤表皮质量的10%、40%。比较移植后2、3、4周2组大鼠创面的愈合率、收缩率,观察2、4周时角蛋白19、整合素β1的表达与分布特征。结果移植后2、3周,混合皮组大鼠创面愈合率分别为(85±5)%、(84±8)%,明显高于自体皮组的(53±10)%、(65±9)%(P<0.01)。2组创面收缩率在移植后各时相点差异无统计学意义(P>0.05)。移植后2、4周,2组大鼠创面新生表皮的颗粒层和棘层均可见角蛋白19、整合素β1阳性细胞;此期间未见角蛋白19在基底层有所表达。移植后2周,2组创面基底层未见整合素β1阳性细胞;4周时,部分创面标本中有整合素β1阳性细胞在基底层间断出现。结论自、异体微粒皮混合移植有助于创面愈合。自体微粒皮和自、异体微粒皮混合移植创面中,均存在角蛋白19和整合素β1阳性细胞的异位表达。

人角质形成细胞基因导入效率的影响因素研究

目的了解不同大小质粒和不同基因转染法对人KC基因导入效率的影响。方法采用脂质体转染法、阳离子多聚物转染法、电穿孔联合细胞核转染试剂转染法、慢病毒感染法，分别将不同大小的质粒[pSUPER-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、pEGFP—N2、pHSER-绿色荧光蛋白（GFP）、ploxP-EGFP]导入人永生化KC株HaCaT细胞和人胚肾细胞株293FT细胞（后者为对照）。于倒置荧光显微镜下观察GFP的表达，计算转染率。结果（1）采用脂质体转染法可将4种质粒导入HaCaT细胞（转染率1．0％～3．3％）及293FT细胞（转染率80．0％～84．7％）。（2）阳离子多聚物转染法亦可将4种质粒导入HaCaT细胞（转染率为1．0％～3．7％）和293FT细胞（转染率81．3％～86．7％）。（3）采用电穿孔联合细胞核转染试剂转染法，可以将2种较小片段质粒pSUPER—EGFP和pEGFP-N2导入HaCaT细胞，转染率分别为22．3％和19．0％；而2种较大片段质粒pHSER-GFP和ploxP-EGFP的转染率分别为4．0％和3．3％。（4）pHSER-GFP经慢病毒包装后，导入HaCaT细胞的转染率高达97．0％，明显优于前3种转染法。结论脂质体转染法、阳离子多聚物转染法较难将外源性基因导入人KC，慢病毒感染法的转染率明显优于电穿孔联合细胞核转染试剂转染法；

人CCL20基因打靶载体的构建与鉴定

目的:构建针对人CC亚族趋化因子配体20(CC chemokine ligand20,CCL20)基因外显子2的置换型打靶载体。方法:设计和合成引物,利用长距离聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)从永生化人角质形成细胞系(HaCaT)基因组DNA中克隆出CCL20基因组DNA片段,再以CCL20基因为模板扩增出长度为1969bp的同源短臂和2356bp的同源长臂,分别插入ploxP载体的Neo基因上游和下游,构建针对人CCL20基因外显子2的置换型打靶载体(ploxP-hCCL20)。将打靶载体线性化并以电穿孔方法转移入HaCaT,观察克隆的形成。结果:经过PCR、限制性内切酶鉴定及DNA序列测定,证实该载体的两条同源臂包含人CCL20基因的外显子1、3、4及其邻近的部分内含子。结论:ploxP-hCCL20载体构建成功,增加Neo基因下游同源臂长度的策略有可能提高细胞基因敲除的同源重组率。