过量表达NADH氧化酶加速光滑球拟酵母合成丙酮酸

【目的】进一步提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)发酵生产丙酮酸的生产强度。【方法】将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶noxE基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株T.glabrata CCTCCM202019中,获得了一株NADH氧化酶活性为34.8U/mg蛋白的重组菌T.glabrata-PDnoxE。【结果】与出发菌株T.glabrata CCTCC M202019相比,细胞浓度、葡萄糖消耗速率和丙酮酸生产强度分别提高了168%、44.9%和12%,发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕。补加50g/L葡萄糖继续发酵20h,则使丙酮酸浓度提高到67.2g/L。葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度增加的原因在于形成水的NADH氧化酶过量表达,导致NADH和ATP含量分别降低了18.1%和15.8%,而NAD+增加了11.1%。【结论】增加细胞内NAD+含量能有效地提高酵母细胞葡萄糖的代谢速度及目标代谢产物的生产强度。

葡萄糖酸钠对光滑球拟酵母CCTCC M202019能量代谢和丙酮酸积累的影响

在好氧条件下,光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019能够利用葡萄糖酸钠为唯一碳源生长并积累少量丙酮酸。在含有90 g/L葡萄糖的培养基中,16 h时添加10 g/L葡萄糖酸钠,与100 g/L葡萄糖作为唯一碳源的对照组相比,细胞质量浓度、葡萄糖消耗速率、丙酮酸生产强度分别提高7.96%、13.04%和32.81%;其原因在于葡萄糖酸钠的添加,使胞内NAD+浓度提高了29.73%,NADH/NAD+比值和ATP含量分别下降26.89%和8.50%,此变化显著缓解了NADH和ATP对于糖酵解途径的抑制作用,从而显著加快糖酵解速率。

工业微生物中NADH的代谢调控

NADH是微生物代谢网络中的一种关键辅因子。调节微生物胞内NADH的形式与浓度是定向改变和优化微生物细胞代谢功能,实现代谢流最大化、快速化地导向目标代谢产物的重要手段之一。以下在详尽总结了NADH生理功能的基础上,从生化工程(添加外源电子受体、不同氧化还原态底物及NAD合成前体物、调节培养环境和氧化还原电势)和代谢工程(过量表达NADH代谢相关酶、缺失NADH竞争途径及引入NADH外源代谢途径)两方面分析、归纳了NADH代谢调控策略,进而凝练出调控NADH/NAD+比率调节微生物细胞代谢功能研究方面亟待解决的3个科学问题及可能的解决途径。

异源表达NADH选择性氧化酶提高光滑球拟酵母酵解速率及丙酮酸生产强度

【目的】进一步提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)葡萄糖代谢速率及丙酮酸生产强度。【方法】将源于荚膜胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的编码选择性氧化酶的AOX1基因过量表达于T.glabrata中,获得了一株线粒体内NADH氧化途径发生改变且胞内总NADH氧化酶活性提高1.8倍的重组菌株AOX。【结果】与出发菌株CON比较,细胞浓度以及发酵周期降低了20.3%和10.7%,而平均比葡萄糖消耗速率和丙酮酸合成速率分别提高了34.7%和54.1%。其原因在于NADH选择性氧化酶过量表达,导致胞内NADH/NAD+比率和ATP含量分别降低了74.7%和52.9%,而磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性分别提高了185.0%和28.1%。【结论】构建线粒体内非产能的NADH氧化途径,加速NADH氧化的同时降低ATP合成,能有效地提高酵母细胞糖酵解代谢速度及目标代谢产物的生产强度。