环割对葡萄VvNCED基因的表达和果实成熟的影响

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)为脱落酸(ABA)合成途径的关键基因,参与果实生长发育。为明确NCED基因家族对葡萄果实成熟的调控功能,以鄞红葡萄为材料,在开花后50 d进行环割处理,以不环割为对照,分析其果实成熟期、内源脱落酸含量和NCED家族中6个成员表达的变化;通过克隆这6条基因编码区目的片段,构建了pCambia1302过表达植物载体,在花蕾期用农杆菌侵染液浸泡花序,以空载和野生型为对照,分析农杆菌侵染后的果肉中ABA含量和基因表达变化。结果表明,环割后鄞红葡萄果实较对照提前成熟13 d左右;实时荧光定量PCR分析结果显示,环割处理7 d后的果肉中VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7表达量显著上调,与葡萄果肉中内源ABA变化相关;农杆菌侵染花穗后阳性转基因果肉中VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7基因表达量和ABA含量显著高于野生型。综上可知,VvNCED1、VvNCED3、VvNCED4和VvNCED7的表达具有调控葡萄果实成熟的作用。本研究结果为葡萄成熟期的分子调控提供了理论基础。

葡萄TPS基因家族的鉴定与表达分析

为了明确TPS基因家族在葡萄非生物胁迫下的表达特性,在生物信息分析的基础上,以‘鄞红’葡萄(Vitis vinifera‘Yinhong’)扦插苗为试验材料,利用RT-qPCR技术检测了盐胁迫和光胁迫处理对葡萄TPS家族基因成员表达的影响。结果显示,葡萄TPS基因家族有9个成员,可分为3个亚族,分布在8条染色体上。通过氨基酸多重序列比对,发现葡萄(Vitis vinifera)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)TPS家族基因都存在G-X-FLH-X-PFPS-X-E-X5-P-X-R和X-F-X-T-X-D-X-ARHF-X2的特征序列。motif分析发现,VvTPS06和VvTPS07两个基因含有相同的氨基酸保守序列。亚细胞定位预测显示葡萄TPS基因主要分布在细胞质、叶绿体和细胞核中,其中VvTPS06、VvTPS07、VvTPS09定位于叶绿体中可能与植物光合作用相关。蛋白质二级结构表明,葡萄TPS蛋白主要以α-螺旋和无规则卷曲为主。基因芯片表达显示,VvTPS02、VvTPS03、VvTPS05、VvTPS07在葡萄不同时期不同组织均处于高表达状态,其中VvTPS07尤为明显。RT-qPCR分析结果表明,在盐胁迫中各VvTPS基因存在相似的表达模式,VvTPS05、VvTPS07和VvTPS09的表达量在高浓度盐胁迫(0.6%)时出现一定程度的升高,这表明VvTPS05、VvTPS07和VvTPS09基因与植物耐盐性关系密切,可为葡萄逆境胁迫机制研究提供参考。在光胁迫中,当遮光率达90%时,VvTPS02、VvTPS07和VvTPS09的表达量相比于对照组明显增加,推测其通过提高其表达量来促进光合作用,从而弥补光照的缺失。

‘鄞红’葡萄HDR基因的克隆与生物信息学分析

4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(HDR)作为甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径的关键酶,在植物萜类物质合成过程中起到极为重要的作用。为了了解HDR基因在植物体内发挥的特殊功能,以‘鄞红’葡萄为材料,利用RT-PCR等技术克隆了HDR基因全长,并对该基因进行生物信息学分析。结果显示,HDR基因全长为1143 bp,编码380个氨基酸。通过多种软件比对分析,‘鄞红’葡萄与柑橘(Citrus sinensis)、南瓜(Manihot esculenta)、猕猴桃(Actinidia deliciosa)、黄瓜(Cucumis sativus)的相似性高达80%以上,亲缘关系较近。该结果为进一步研究‘鄞红’葡萄HDR的功能以及揭示该基因在植物萜类物质合成过程中发挥的作用提供了一定基础。

葡萄果实CYP707A基因的克隆与表达分析

8’-羟化酶(8’-hydroxylase)是脱落酸代谢途径中的关键酶,由CYP707A基因家族编码。该酶降解脱落酸生成红花菜豆酸(PA),对果实生长发育及成熟有重要作用。本研究分析了‘鄞红’葡萄中CYP707A基因的结构,并对果实发育过程中幼果期、膨大期、转色期、成熟期和过熟期CYP707A基因表达量和ABA含量二者间相关性进行了探讨。结果发现,‘鄞红’葡萄中含有一个新的CYP707A基因,命名为VvCYP707A1,该基因编码区长1 995 bp,有一个1 413 bp的完整开放阅读框(ORF),编码653个氨基酸;VvCYP707A1编码的蛋白属于疏水性跨膜蛋白,且亚细胞定位于内质网,预测蛋白与该蛋白家族不同种属来源序列相似度约为54.21%,具有保守的P450半胱氨酸血红素铁配位体,属8’-羟化酶家族。在果实成熟过程中,ABA含量和VvCYP707A1基因表达量变化总趋势为上升,并呈正相关;VvCYP707A1基因表达量呈上升趋势,过熟期达到最大。本研究完善了‘鄞红’葡萄CYP707A基因家族序列,为今后探究并验证其功能和果实成熟间的联系提供了数据参考。

脱落酸信号转导途径在植物应对非生物胁迫响应中的作用

脱落酸(abscisic acid, ABA)是植物用来抵抗外界威胁的一种重要激素,它通过影响其信号通路中下游调控因子的转录和转录后修饰,控制植物对生物和非生物环境胁迫作出响应,从而增强植物的抗性。其核心反应首先是脱落酸受体接受脱落酸分子信号后,变构抑制蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C, PP2C)的活性,从而减轻或消除PP2C对蔗糖非发酵相关蛋白激酶2(sucrose non-fermented related protein kinase 2, SnRK2)的抑制,增强SnRK2激酶对底物蛋白的磷酸化来调节植物脱落酸的总体反应。其次,当感知到外界威胁时植物通过激活编码脱落酸生物合成酶基因的表达,促进脱落酸的生物合成和积累,从而激活脱落酸信号通路中下游胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant proteins, LEA)的表达,增多的LEA蛋白可以保护细胞膜的稳定性从而增进植物的抗逆性。另外,脱落酸在触发保卫细胞气孔关闭方面也起关键作用,脱落酸可以调节细胞离子通量,介导气孔闭合,减少水分流失。

‘鄞红’葡萄PP2C基因的克隆与生物信息学分析

PP2C是一类重要的蛋白磷酸酶,广泛参与各种逆境胁迫响应。为了了解PP2C基因在植物体内发挥的特殊功能,以‘鄞红’葡萄为材料,利用RT-PCR等技术克隆了全长,并对该基因进行生物信息学分析。结果显示,PP2C基因全长为1522 bp,其中开放阅读框(ORF)长度为1512 bp,编码506个氨基酸。通过多种软件比对分析,‘鄞红’葡萄与柑橘(Citrus sinensis)、樱桃李(Prunus avium)、草莓(Fragaria vesca)、黄瓜(Cucumis melo)的相似性高达95%以上,亲缘关系较近。该结果为进一步研究‘鄞红’葡萄PP2C蛋白功能以及揭示该蛋白在植物响应非生物胁迫过程中发挥的作用提供了一定基础。

‘鄞红’葡萄cyFPB基因克隆及其表达分析

胞质1,6-二磷酸果糖酶(cyFPB)是糖异生途径关键调控基因,对植物果实的糖含量积累与发育有重要的调控作用。为了了解cyFPB基因在葡萄果实发育过程中的功能,本研究以完熟期‘鄞红’葡萄果实为材料,利用RT-PCR等技术克隆了全长,并对该基因进行生物信息学分析。同时,以‘鄞红’葡萄不同成熟时期的果实为材料,利用RT-qPCR测定cyFPB的表达量。结果显示,cyPFB基因全长为1 158 bp,其中开放阅读框(ORF)度为1020bp,编码了339个氨基酸。通过序列比对分析显示‘,鄞红’cyFPB与霞多丽在遗传关系上极为接近,不同物种cyFPB的氨基酸序列相似度高达80%。RT-qPCR测定发现:在‘鄞红’葡萄果实发育时期,cyFPB的表达量显著上升,其中完熟期cyFPB的表达量最大。由此说明cyFPB基因对‘鄞红’葡萄果实发育有重要的调控作用。