A549-KIF4A过表达细胞株的构建与鉴定

非小细胞肺癌A549细胞中驱动蛋白KIF4A的表达量极低.为研究KIF4A在肺癌发生和发展过程中的作用,利用脂质体转染的方法,将p EGFP-KIF4A质粒和p EGFP-C1质粒分别转入A549细胞中,用G418筛选得到单克隆,并扩增得到稳定表达GFP-KIF4A和GFP的细胞株.利用Western Blot以及免疫荧光染色法对得到的细胞株进行鉴定.结果表明:A549-GFP-KIF4A细胞中GFP-KIF4A蛋白的表达水平较高,A549-GFP-C1中仅表达GFP蛋白.免疫荧光检测表明:A549-GFP-KIF4A过表达细胞中GFP-KIF4A荧光融合蛋白的定位与内源KIF4A的定位相同.

组织蛋白表达水平检测方法的比较分析

为了得到一种能够准确、快速检测组织蛋白表达水平的方法,收集了12例结肠癌病人的癌组织及癌旁组织,以RRP15 mRNA的表达水平作为参照,比较免疫组织化学染色法和免疫荧光染色法在检测组织蛋白表达水平方面的优劣.免疫组织荧光染色结果显示,12例患者中有8例患者肿瘤组织的RRP15表达为阳性,4例为阴性,其结果与Real-time PCR定量结果高度一致.免疫组织化学染色结果显示,12例患者中有9例患者肿瘤组织的RRP15表达为阳性,其余3例为阴性,其中6号和11号免疫组织化学检测为阴性,而Real-time PCR定量和免疫组织荧光染色结果均为阳性,即免疫组化检测结果与Real-time PCR定量结果的一致性较差.因此认为,免疫荧光染色法是检测组织中蛋白表达水平的首选方法,免疫组织化学染色法可作为一种辅助方法.

KIF4A mRNA在肺癌组织中表达水平的研究

收集肺癌组织标本和正常肺组织标本,提取组织中的RNA,通过反转录PCR合成cDNA,进行实时定量PCR测定.结果表明:31例肺癌组织中有29例KIF4A mRNA的表达量高于正常组织,其中26例(83.87%)比正常组织高2倍以上,10例(32.30%)比正常组织高4倍以上;KIF4A mRNA的表达量与肿瘤淋巴结转移(TNM)分期的相关性具有统计学意义(F=0.565,P=0.029).由于肺癌组织中KIF4A mRNA的表达量升高与肿瘤的分期分型相关,因此可以作为判断肺癌分期及预后的新分子标志物,对于评估肺癌的发生与发展也可能具有重要意义.

RRP15过表达对核糖体生物发生和细胞增殖的影响

为了明确核糖体RNA加工蛋白15(RRP15)在肿瘤发生发展中的作用,通过构建稳定过表达RRP15的HeLa细胞株HeLa-Flag RRP15及其对照细胞株HeLa-Flag,利用细胞免疫荧光、蛋白免疫印迹等方法研究了RRP15过表达对核仁结构的影响,利用蔗糖密度梯度离心法提取核糖体大小亚基前体,探究了RRP15过表达对核糖体生物发生的影响,利用MTT实验和蛋白免疫印迹检测了RRP15过表达对细胞生长增殖的影响.结果发现,RRP15过表达使细胞核仁数量增多,核仁蛋白表达量上调,核糖体大小亚基前体生物发生水平均有提高,细胞生长增殖速率加快,细胞周期相关蛋白的表达增加.由此认为,RRP15可能通过增加核仁数量和提高核糖体生物发生水平增强细胞的增殖能力,进而促进肿瘤的发生与发展.

核糖体蛋白RPL15多克隆抗体的制备与细胞内定位

为了解核糖体大亚基蛋白RPL15在细胞中的定位和功能,设计并合成了RPL15蛋白的多肽,作用于抗原免疫兔子,使其产生特异性多克隆抗体,利用蛋白免疫印迹和免疫荧光方法检测RPL15抗体的特异性.结果证实本研究成功制备并纯化了RPL15的多克隆抗体,且该抗体可以特异性识别RPL15蛋白.免疫荧光实验表明RPL15定位于细胞质和细胞核中,主要定位于核仁并呈点状分布,且与UBF、FBL和C23存在部分共定位.

黏着斑蛋白supervillin对胃癌细胞侵袭的促进作用

为了研究黏着斑蛋白supervillin(SVIL)在胃癌细胞(SGC)侵袭转移过程中所发挥的作用,利用脂质体转染的方法,将人源的p QCXIP-supervillin(pQCXIP-SVIL)质粒和pEGFP-C1质粒分别转入SGC细胞中,用G418或嘌呤霉素筛选得到稳定表达的GFP-SVIL(SGC-GFP-SVIL)和GFP(SGC-GFP-C1)细胞株,然后应用蛋白免疫印迹法(Western Blot)对这些细胞株进行鉴定,最后应用细胞侵袭实验对SGC、SGC-GFP-C1及SGC-GFP-SVIL细胞的侵袭能力进行比较,并对细胞SVIL、DNA以及皮层肌动蛋白进行免疫荧光染色.结果证实本研究成功构建了SGC-GFP-SVIL和SGC-GFP-C1细胞株.同SGC和SGC-GFP-C1细胞相比,过表达GFP-SVIL蛋白分子的SGC-GFP-SVIL细胞的侵袭能力更强.GFP-SVIL与皮层肌动蛋白在细胞中存在共定位,皮层肌动蛋白是侵袭性伪足的标志蛋白,与SGC及SGC-GFP-C1细胞相比,SGC-GFP-SVIL细胞中侵袭性伪足数量明显增加.根据这些结果认为,SVIL可能通过调节皮层肌动蛋白的表达和影响该蛋白分子在侵袭性伪足上的定位,从而影响胃癌细胞的侵袭能力.

驱动蛋白Kif22多克隆抗体的制备、纯化及免疫特异性检测

为深入研究驱动蛋白分子Kif22在细胞内的功能,应用分子克隆技术构建原核细胞表达质粒p HIS8-Kif22C156和p GEXKG-Kif22C156,并在细菌BL-21中诱导表达HIS8-Kif22C156和GST-Kif22C156.用Ni-NTA琼脂糖结合HIS8-Kif22C156蛋白进行蛋白纯化,然后免疫新西兰大白兔制备特异性多克隆抗Kif22抗体;用谷胱甘肽琼脂糖结合GSTKif22C156蛋白进行交联,纯化多克隆兔抗Kif22抗体.蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光染色实验证明纯化的抗体可以特异性识别细胞中的Kif22蛋白,表明Kif22多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度.

核仁蛋白RRP15在细胞有丝分裂期的表达与定位

为了明确核糖体RNA加工蛋白15(RRP15)在细胞周期不同时期的表达情况与亚细胞定位,以稳定表达GFP-RRP15的He La细胞为实验材料,利用细胞同步化以及蛋白免疫印迹方法研究RRP15在细胞周期不同时期的表达情况,利用细胞免疫荧光染色以及活细胞成像检测RRP15在有丝分裂期的亚细胞定位,利用染色体提取探究RRP15与有丝分裂期细胞染色体的关系.结果发现,RRP15在整个细胞周期中均有稳定表达,且在G1期表达微量上调;在有丝分裂期,RRP15定位于染色体外周和中小体,始终伴随染色体,且染色体外周定位不依赖于DNA.

驱动蛋白Kif4A杆状病毒表达系统的构建与优化

目的为了探究人驱动蛋白分子Kif4A在有丝分裂过程中的作用及其调节机制,需要在体外表达并纯化有活性的Kif4A蛋白。方法构建了驱动蛋白Kif4A的体外真核表达载体pFastBac-Kif4A,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆,抽提得到杆状病毒基因组。由于杆状病毒基因组较大,标准的转染方法转染效率较低,对该方法进行了优化。将杆状病毒基因组通过标准的和优化的转染方法转染到草地夜蛾卵巢细胞SF9中,经培养得到表达驱动蛋白Kif4A的初代杆状病毒。结果通过检测初代杆状病毒的滴度,我们发现,与标准的转染方法相比,优化的转染方法所得到的初代杆状病毒的滴度更高,相同稀释度感染条件下表达的Kif4A蛋白水平更高。结论本研究成功构建了Kif4A杆状病毒表达系统,并优化了SF9细胞转染的方法,为后续大量表达和纯化Kif4A蛋白奠定了基础。

染色体驱动蛋白KIF4A对胃癌细胞迁移和转移的影响

目的前期的研究证实,染色体驱动蛋白KIF4A在胃癌组织中低表达,过表达KIF4A抑制了胃癌细胞的增殖。本研究进一步研究KIF4A与胃癌细胞迁移与转移的关系,从而为胃癌临床治疗提供新的治疗靶点。方法应用组织芯片和免疫荧光染色技术研究胃癌及其周围淋巴结组织中KIF4A蛋白分子的表达差异性;利用细胞小分子RNA干扰和Transwell迁移实验,检测KIF4A对细胞迁移运动能力的影响。结果 65%(26/40)的胃癌组织中KIF4A蛋白分子表达水平低于周围的淋巴结组织;KIF4A的表达水平与胃癌组织的TNM分期密切相关;KIF4A蛋白分子的表达随胃癌转移侵袭能力的增强而降低;抑制胃癌细胞内KIF4A蛋白分子的表达明显增强胃癌细胞的迁移运动能力。结论染色体驱动蛋白分子KIF4A通过抑制胃癌细胞的迁移运动能力参与控制胃癌的临床转移过程。

染色体驱动蛋白KIF4A稳定低表达胃癌细胞系的构建及鉴定

目的 构建稳定低表达染色体驱动蛋白KIF4A的胃癌细胞系,观察KIF4A低表达细胞的有丝分裂期纺锤体中央区的形成.方法 针对人类驱动蛋白KIF4A mRNA的编码区设计特异性siRNA序列,构建KIF4A短发夹RNA（shRNA）表达质粒pGPU-GFP-KIF4A.将质粒转染胃癌细胞SGC-7901,经过G418筛选获得稳定低表达KIF4A的细胞株.使用蛋白免疫印迹方法鉴定细胞株内KIF4A蛋白的敲降效果,并通过细胞免疫荧光染色法观察细胞纺锤体中央区的形成.结果 成功获得了3株不同水平稳定低表达KIF4A的SGC-7901细胞株（SGC-shKIF4A）和稳定表达无意义shRNA的对照细胞（SGC-shNC）;同时,与对照细胞SGC-shNC相比,SGC-shKIF4A细胞中有丝分裂纺锤体中央区延长,并随KIF4A蛋白表达水平的降低而增加.结论 成功构建了不同水平稳定低表达KIF4A蛋白的胃癌细胞SGC-shKIF4A,为进一步研究驱动蛋白分子KIF4A的功能及其在胃癌发生发展过程中的作用奠定基础.

RNaseⅢ制备的小分子干扰RNA（esiRNA）文库构建及优势分析

目的建立KIF4A核糖核酸内切酶Ⅲ酶切制备的小分子干扰RNA（esiRNA）文库，并探讨这种新型siRNA制备方法的优势。方法制备502bp的KIF4A基因组序列作为转录模板；体外转录获得双链RNA；用核糖核酸内切酶ⅢGST融合蛋白（GST-RNaseⅢ）酶切双链RNA，制备KIF4AesiRNA文库；应用KIF4AesiRNA和化学合成的KIF4AsiRNA转染胃癌细胞株SGC-7901，应用Q-RTPCR和WesternBlot分别检测KIF4A的mRNA和蛋白水平。结果利用GST-RNaseⅢ成功制备了KIF4AesiRNA文库，该文库可有效抑制SGC．7901细胞内的KIF4A表达，且抑制效果明显优于化学合成的KIF4AsiRNA。结论用生物学方法制备的KIF4AesiRNA文库可有效抑制KIF4A在细胞内的表达，且抑制效果优于化学合成的siRNA。

黏着斑蛋白Supervillin的抗体制备及纯化

黏着斑蛋白Supervillin(SVIL)是一个细胞膜结合蛋白分子,定位于细胞与细胞外基质接触面的黏着斑。为了进一步研究SVIL蛋白分子在细胞内的功能,应用分子克隆技术构建原核细胞表达质粒pGEXKG-SVILC302和pHIS8-SVILC302,并在细菌BL-21(DE3)中用IPTG分别诱导表达GST-SVILC302和HIS-SVILC302融合蛋白。用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化GST-SVILC302蛋白,然后免疫新西兰大白兔制备SVIL多克隆抗体,并用Ni-NTA柱子结合HIS-SVILC302蛋白,对其进行交联,纯化抗体。Western Blot(WB)和Immunofluorescence(IF)实验证明该抗体可以识别外源的GFP-SVIL和内源的SVIL蛋白,并且可以用于蛋白免疫沉淀实验。表明此SVIL多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度,为进一步研究黏着斑蛋白SVIL在细胞内的功能奠定了坚实的基础。

一种连续蔗糖密度梯度离心分离哺乳动物细胞核糖体前体和核糖体的技术优化

目的利用连续蔗糖密度梯度的方法分离提取哺乳动物细胞的核糖体前体和核糖体。方法采用超速离心法建立连续蔗糖密度梯度，分别用梯度为10％～30％和10％-45％的连续蔗糖密度梯度提取哺乳动物细胞内的核糖体前体和核糖体；然后将哺乳动物细胞裂解液加入到已建立好的连续蔗糖密度梯度上进行超速离心；再将不同沉降系数的核糖体前体和核糖体收集到不同的1．5ml离心管中，测量每一个样品的吸光度值A。并提取其中的蛋白质，利用WesternBlot检测核糖体大亚基蛋白RPL15的定位。结果核糖体大亚基蛋白RPL15位于核糖体前体的60S上和成熟核糖体的60S、80S和多聚核糖体上。结论利用水平转头建立的连续蔗糖密度梯度可快捷分离哺乳动物细胞内的核糖体前体和核糖体。该法分离效果好，操作简单，为快速和大量制备、分离多种核糖体提供了一种良好的方法。

染色体驱动蛋白KIF4A参与调控肺癌细胞顺铂耐药

目的研究染色体驱动蛋白KIF4A参与肺癌细胞顺铂耐药过程。方法采用逆转录PCR（RT．PCR）及Western Blot实验检测并比较肺癌细胞株A549及其顺铂耐药衍生细胞株A549／DDP中染色体驱动蛋白KIF4A的表达。先用细胞转染技术在A549细胞中过表达外源性KIF4A，或用RNA干扰（RNAi）技术敲降A549／DDP细胞中内源性KIF4A的表达，再用顺铂处理上述细胞，最后通过噻唑蓝（MTY）比色法检测细胞的增殖能力。结果染色体驱动蛋白KIF4A在A549／DDP细胞中mRNA和蛋白质的表达均高于A549细胞。在A549细胞中过表达外源性KIF4A，导致细胞耐受顺铂药物，且细胞增殖能力不受顺铂药物处理的影响。相反，在A549／DDP细胞中敲降KIF4A的表达，导致A549／DDP细胞对顺铂药物敏感，细胞增殖能力下降。结论驱动蛋白分子KIF4A参与调控肺癌细胞A549的顺铂耐药过程，故KIF4A可作为潜在的有效治疗肺癌顺铂耐药的新型生物靶标。

驱动蛋白KIF4A抑制胃癌细胞的侵袭作用

目的应用胃癌细胞SGC-7901以及稳定低表达驱动蛋白KIF4A的胃癌细胞SGC-shKIF4A，研究KIF4A对胃癌细胞侵袭能力的作用。方法使用蛋白免疫印迹法鉴定对照胃癌细胞SGC-shNC以技SGC-shKIF4A细胞内KIF4A蛋白的表达水平．并通过细胞侵袭实验计数这两种细胞的侵袭能力。通过细胞免疫荧光染色法观察在SGC-7901、SGC-shNC、SGC-shKIF4A细胞中皮层肌动蛋白（cortactin）的数量变化情况。结果 与对照细胞SGC-shNC相比，SGC-shKIF4A细胞侵袭能力明显增强；与其他细胞相比，SGC-shKIF4A细胞的cortactin数量明显增多（P〈0．01），表明该细胞内侵袭性伪足增多.结论 驱动蛋白KIF4A具有抑制胃癌细胞的侵袭作用，这为KIF4A作为靶点应用胃癌的预后预测以及有效治疗奠定理论基础。